论文摘要
目的:脑出血是神经系统常见病,致死、致残率很高,探讨脑出血后脑组织损伤机制是目前临床和实验研究的热点。近年来,动物实验和临床研究都表明细胞凋亡机制参与了出血后脑损伤,细胞凋亡与脑出血病程及预后密切相关。进一步研究脑出血后细胞凋亡信号传导机制和如何早期减少细胞凋亡以促进神经功能的恢复对指导临床治疗有重要意义。因此本实验通过在大鼠脑出血模型上进行血肿抽吸,观察出血侧尾状核区细胞凋亡、凋亡执行者—Caspases-3以及凋亡传导信号Cyt c、Fas的时程变化,并与未经治疗的脑出血组比较,探讨早期血肿抽吸术对细胞凋亡途径的干预作用及其机制。方法:取健康雄性SD大鼠39只随机分为4组,第1组为正常组,第2组为假手术组,第3组为脑出血（ICH组）,第4组为血肿抽吸组。ICH组又分为6h、12h、24h、3d、7d、11d六个时间点,抽吸组又分为12h、24h、3d、7d、11d五个时间点。将0.4units的Ⅳ型细菌胶原酶立体定向注入大鼠右侧尾状核建立脑出血模型。未做任何处理的大鼠作为正常组;生理盐水代替胶原酶注入大鼠尾状核后6小时处死的作为假手术组;只注入胶原酶不进行抽吸的为ICH组;在胶原酶注入大鼠尾状核后6小时进行立体定向血肿抽吸的作为血肿抽吸组。在相应的时间点用过量4%水合氯醛麻醉动物,迅速开胸暴露心脏,4%多聚甲醛200ml快速灌注,断头取脑,按常规程序制成厚度5μm的石蜡切片,并制成组织芯片,用凋亡原位末端标记技术（TUNEL）和免疫组化方法检测凋亡细胞、Caspase-3、Cyt c和Fas的表达。结果:1.正常组大鼠大脑皮质可见少量TUNEL阳性细胞,假手术组在针道周围有散在TUNEL阳性细胞。脑出血组TUNEL阳性细胞在脑出血后6h明显增多,与假手术组比较有显著性（P<0.05）,12h继续增加,24h～3d时达高峰,然后逐渐减少,11d时仍有较多阳性细胞。血肿抽吸组12h,24h,3dTUNEL阳性细胞数较ICH组明显减少（P<0.05）。2.正常组和假手术组两侧大脑半球只见零星Caspase-3染色阳性的细胞,脑出血组6h在血肿区及血肿周边Caspase-3表达开始增加,与假手术比较差异有显著性（P<0.05）,表达在3d时达高峰,7d开始回落,至11d时Caspase-3回落到6h水平。脑出血后11d内Caspase-3表达和神经细胞凋亡呈正相关（r=0.711,P<0.01）。血肿抽吸组3d,11dCaspase-3阳性细胞数较ICH组明显减少（P<0.05）。3.正常对照组未发现Cyt c阳性神经元,假手术组见到极少量阳性细胞,脑出血组在脑出血后6h血肿周围发现阳性细胞,与假手术比较差异有显著性（P<0.05）,12h后血肿周围的阳性细胞明显增加,3d达高峰,11d明显下降。脑出血后11d内Cyt c表达和神经细胞凋亡呈正相关（r=0.808,P<0.01）。血肿抽吸组12h,24h,7d,11dCyt c阳性细胞数较ICH组明显减少（P<0.05）。4.假手术组及正常组对照组基底节区均未检测到Fas蛋白表达。脑出血组在脑出血后6h基底节区Fas表达开始增加,3d达高峰,此后逐渐减少,11d仍见少量表达。脑出血后11d内Fas表达和神经细胞凋亡呈正相关（r=0.867,P<0.01）。血肿抽吸组12h,7dFas阳性细胞数较ICH组明显减少（P<0.05）。结论:1.脑出血后血肿周围神经细胞损伤有凋亡机制参与,细胞凋亡重要调控因子Caspase-3的表达与脑出血后细胞凋亡的发生发展密切相关。2.脑出血后血肿周围神经细胞凋亡途径包括线粒体途径和死亡受体途径: Cty c和Fas的释放分别是这两条细胞凋亡途径中的关键事件。3.立体定向血肿抽吸术治疗可以有效减少大鼠脑出血后血肿周围细胞凋亡,其机制之一可能是减少了凋亡途径中Cty c和Fas的释放。