论文摘要
目的:G-CSF目前被广泛地应用于外周血造血干细胞移植,尽管在采集物的细胞中CD3+的细胞数增加了十倍,但是严重的急性GVHD的发生率并没有增加。G-CSF目前被称为具有T细胞免疫耐受作用的免疫调节因子（Mediator of T Cell Tolerance）,目前对G-CSF诱导免疫耐受机制的研究主要有以下几个方面:对T细胞影响,rhG-CSF动员使Th细胞向Th2发生极化,CD4+Th细胞激活后分化为功能不同的Th1和Th2效应细胞。Th1细胞分泌IL—2、IFN—γ、TNF—β等,介导细胞免疫应答、在BMT中介导aGVHD的发生。Th2细胞产生IL—4、IL—5、IL—6、IL—9、IL—10、IL—13等细胞因子,介导体液免疫应答,在BMT中和减少aGVHD的发生有关。此外对T细胞增殖、分化、凋亡均有影响。目前仍需阐明的问题G-CSF的作用是直接作用于T细胞还是通过其他细胞因子间接的作用? G-CSF作用下,影响T细胞向TH2分化的原因有哪些? G-CSF诱导T细胞向TH2分化是受何种转录因子调控?以上问题的解决将为今天通过干预T细胞向TH2分化,降低aGVHD的发生奠定理论基础。方法:本研究采取G-CSF体内和体外刺激两种方式:体外刺激方式时,抽取健康志愿者外周血,分离单个核细胞。CD4细胞免疫磁珠分离、CD4+T淋巴细胞,在体外应用不同浓度G-CSF刺激,观测体外G-CSF对T淋巴细胞的直接作用。体内研究选取临床上进行骨髓或外周血造血干细胞移植的供者,在G-CSF动员前后采取标本,纯化CD4+T淋巴细胞,观测G-CSF体内刺激对T细胞的作用。主要的研究内容包括MTT方法检测G-CSF对T淋巴细胞增殖和抗原反应性的影响,混合淋巴细胞反应（MLR）检测T细胞的抗原反应性。FCM方法检测TH1/TH2比率。Real—time PCR检测G-CSF刺激淋巴细胞分化相关基因表达的变化。包括G-CSF受体基因（G-CSFR）、CD4+淋巴细胞分泌细胞因子的基因（IL-4、IFN-γ）一些分化调控及转录因子基因（CD28、CTLA-4、ICOS、GATA3、T-bet、FOXP3）。结果:经过CD4免疫磁珠的分离,得到的CD4+T淋巴细胞纯度在95%以上,经过G-CSF的刺激,增殖指数呈时间依赖性增高。在G-CSF处理之前最低,在G-CS处理后的4—8个小时,增殖指数开始上升,在24—48小时,增殖指数达到高峰,超过72小时,增殖指数下降。从LTT的数值和抑制率的分析中,可以表明G-CSF的刺激可以抑制T细胞对PHA的反应能力,对于应用G-CSF刺激后的CD4+T淋巴细胞,细胞的LTT值呈下降趋势,抑制率呈上升趋势。G-CSF在体内和体外刺激同样抑制T淋巴细胞的抗原反应能力,两组没有显著性差异。通过对体内、体外两组刺激方式下的CD4+T淋巴细胞的TH1/TH2分析,结果显示经过G-CSF动员,CD4+T淋巴细胞中分泌IFN-γ的TH1细胞减少,而分泌IL—4的TH2细胞增加,动员后的TH1/TH2比值显著降低。在体内的刺激还是在体外培养的细胞进行G-CSF刺激,对T细胞亚群分化的调节是没有差异的。在体外培养的G-CSF刺激下,平均表达水平升高达到统计学显著性差异的基因有IL-4、CTLA-4、GATA3;平均表达水平降低具有统计学意义的基因是IFN-γ和T-bet。TFN-γ和T-bet基因分别存在显著相关性;IL-4和GATA-3基因也存在相关性。结论:体外G-CSF的刺激可以直接作用于CD4+淋巴细胞,并使之增殖,但是对抗原反应性降低。体外G-CSF的刺激使TH1/TH2比值降低,比值的降低与转录因子GATA3表达水平的增高、T-bet基因表达水平的降低有关,以上结果表明,通过对T淋巴细胞的直接作用,G-CSF可以调节转录因子的水平,从而使T细胞向TH2方向极化,这有可能是G-CSF诱导T细胞免疫耐受的机制之一。目的:随着细胞免疫学和分子生物学的发展,细胞免疫治疗已在临床实验中开展,并取得一定的疗效。树突状细胞（简称DC）是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞（APC）,细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killercells,简称CIK）作为一种新型免疫效应细胞,已经用于多种恶性肿瘤的过继免疫治疗中。DC与CIK是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,前者识别病原、激活获得性免疫系统,后者通过发挥自身细胞毒性与分泌细胞因子杀伤肿瘤细胞,二者联合抗肿瘤免疫反应的完成。本研究旨在优化现有的DC-CIK培养体系,并选择新的细胞因子诱导DC细胞向不同亚群分化。研究报道,FLT3配体（FLT3-L）作为一种细胞因子,可以成功诱导DC的生长,并对DC细胞亚群的分化有作用,它可以诱导浆细胞样DC（IPCs）的生长,增加DC的数量,增强DC的特异性。本研究旨在探讨其在诱导DC中不同亚群分化的作用,以及不同的DC-CIK共培养方式诱导的成熟CIK细胞的特异性免疫表型表达以及对肿瘤细胞杀伤活性的差异。从而为临床DC-CIK治疗提供参考。方法:实验的第一部分:应用FLT3-L刺激移植供者IPCs细胞研究细胞取自正常人外周血单个核细胞。使用FLT3-L诱导DCs成熟作为实验组,GM-CSF作为对照组,进行体外培养,并按计划分别于培养过程中行流式细胞学检查和免疫荧光定量分析,分析不同的细胞因子诱导DC的免疫表型的差异。第二部分:DC-CIK培养体系的建立和优化细胞来源有两种:EBV感染所致的噬血细胞综合症患者的外周血单个核细胞、AML-M4缓解期患者的外周血单个核细胞。EBV感染噬血细胞综合症患者DC培养过程中加入EBV抗原肽后与ClK共培养,比较是否可以培养出克隆性增强的CIK,从而提高CIK的抗瘤活性。AML-M4缓解期患者分别使用FLT3-L/GM-CSF两种细胞因子诱导培养成熟DC,同时进行DC-CIK共培养。培养前后DC分别进行细胞记数、行流式细胞学检查;培养前后ClK分别进行细胞记数、流式细胞学检查、基因扫描图谱分析、杀伤实验。通过一系列的实验分析,选择DC-CIK的最佳培养方案。结果:1关于两种细胞因子对DC诱导培养的影响实验组与对照组细胞数均随细胞培养过程逐渐减少,无明显差异。流式细胞学分析,培养前后,CD14+细胞、CD83+、CD80+细胞、CD86+细胞、CD4+CD123+细胞的数目都明显增多;FLT3-L培养后CD4+CD123+细胞增加明显;比较两种细胞因子诱导培养的DC表型有显著差异,其中GM-CSF组诱导的成熟DC百分比较FLT3-L组高。2 EBV感染患者DC-CIK的培养效果的比较研究细胞生长状态及细胞记数:DC细胞培养3天后细胞数目无发生明显变化。培养第2天于倒置显微镜下可见部分细胞出现毛刺状突起,呈现半贴壁状态。CIK细胞于加入MabCD3和MabCD28后,总生长天数的第4天起出现增殖,倒置显微镜下可见细胞呈现集落样生长,DC-CIK共培养组细胞与CIK组细胞增殖速度无显著性差异,培养14天后,DC-CIK细胞数目和CIK细胞数目分别为培养前6.3倍及5.8倍。培养期内细胞存活率都在95%以上。流式细胞术细胞免疫表型分析:培养前后DC细胞表达HLA-DR+CD86+、CD83+、CD80+均明显增加;经过DC-CIK共培养,CD3+CD8+、CD3+CD56的比例均明显增加,应用空载DC-CIK和负载肽DC-CIK两种培养方式相比较,CD3+、CD8+、CD3+CD56+细胞的比例两者没有显著性差异。培养前后基因谱型图分析:分析培养前后TCRβ24个家族,除培养后负载肽DC-CIK组细胞在TCRβ5.2家族出现克隆性增强的单克隆峰外,培养后空载DC-CIK/负载肽DC-CIK组细胞在其余TCRβ24个家族谱型图中均出现高斯分布现象。杀伤实验结果（IFN-γ分泌值）:表明按不同的效靶比混合后,负载肽DC-CIK组IFN-y分泌量为空载组的1.41.9倍左右,培养后负载肽组CIK对DC的杀伤活性明显强于空载组。3 AML-M4缓解期患者DC-CIK的培养方法比较研究应用AML-M4缓解期患者细胞,应用FLT3-L诱导DC-CIK组细胞数目和GM-CSF诱导DC-CIK组细胞数目无显著性差异,培养14天后分别为培养前6.6倍及6.2倍。流式细胞术细胞免疫表型分析:FLT3-L和GM-CSF两种细胞因子诱导产生成熟DC数目均有所增加,FLT3-L组CD4+CD123+细胞增加高于GM-CSF组。但GM-CSF组CD3+CD56+细胞水平较FLT3-L组增高。培养前后基因谱型图分析:分析培养前后TCRβ24个家族,培养后各家族均出现高斯分布现象,比较培养后两组基因谱型图,未见明显差异。IFN-γ分泌值:培养后IFN-γ分泌值均较培养前明显增高,FLT3-L诱导DC-CIK组IFN-γ分泌值较GM-CSF诱导DC-CIK组增高33.3%。结论:1通过实验摸索,我们用缩短培养时间的14天DC-CIK共培养方法,成功培养出树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞,建立并优化了DC-CIK的培养体系。2对EB病毒感染相关性噬血细胞综合征忠者进行CIK治疗是可行的,可以作为临床辅助治疗方式,在DC的培养中加入EB病毒相关的抗原肽可以刺激T淋巴细胞产生克隆性增强的生长。3 AML患者进行DC-CIK治疗是可行的,可以作为AML缓解期病人的一种辅助性治疗方式,减少微小残留病变。4 FLT3-L与GM-CSF相比,在对DC的体外诱导培养中,也显示出了一些优越性,尤其是对IPCs的影响,
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