油菜硼转运蛋白基因的克隆与鉴定

论文摘要

油菜是世界第二大油料作物,也是我国最重要的油料作物。我国是世界油菜生产大国,而长江流域则是我国的主要油菜产区,其种植面积和总产量均占全国的80%以上,但该区土壤普遍缺硼或严重缺硼。油菜是需硼量较大、对硼比较敏感的作物,缺硼会导致油菜花而不实,严重影响产量和品质。选育和推广能耐低硼的油菜新品种是克服缺硼对产量和品质影响的最为经济有效的对策,然而,常规方法改良油菜低硼耐性未见大的进展。植物基因工程技术的发展和硼转运蛋白基因的克隆与鉴定为改良油菜低硼耐性开辟了新途径。本研究首次从油菜中克隆硼转运蛋白基因并进行生物信息学、基因组中拷贝数和在不同器官中的表达谱分析,构建该基因的过量表达载体并转化油菜以验证其功能,从而为基因工程改良油菜低硼耐性提供依据和奠定基础。主要研究结果如下：1、克隆获得油菜硼转运蛋白基因BnBOR并登录GenBank（登录号GU362414.1）。该基因的mRNA序列全长2112 bp,编码703个氨基酸,其gDNA序列包含有11个内含子和12个外显子。2、生物信息学分析结果表明,BnBOR是一个高分子量的跨膜蛋白,内含11个推断的跨膜功能域。同源性分析和系统发育分析表明,BnBOR与拟南芥AtBOR1、AtBPR2和AtBOR3、水稻OsBOR1和OsBOR3以及莴苣、葡萄、柑橘、玉米、马铃薯、烟草和蓖麻等物种的硼转运蛋白基因聚为同一大类,与这些硼转运蛋白基因的核苷酸序列及其推导氨基酸序列的同源性均在70%以上,其中与AtBORl和AtBOR2的推导氨基酸序列的同源性分别达到97%和91%。3、以硼转运蛋白基因的保守序列作为探针进行Southern杂交分析,结果显示有7条杂交条带。由此推测,同拟南芥和水稻一样,甘蓝型油菜中也可能存在多个不同的硼转运蛋白基因。4、采用RT-PCR方法进行油菜根、茎、叶、花和种子等不同器官中硼转运蛋白基因的表达谱分析,结果表明,硼转运蛋白基因在根和花中的表达较强,茎和叶中次之,种子中最弱。5、利用质粒pFGC-5941将克隆的油菜硼转运蛋白基因构建成由CaMV 35S启动子驱动的过量表达载体,应用农杆菌介导转化技术用该载体转化油菜下胚轴再生获得一批抗性转化植株,经PCR检测共确认阳性植株36株。综上所述,本研究首次克隆了油菜硼转运蛋白基因,了解了该基因的生物学信息,基本明确了该基因在油菜基因组中的拷贝数和在不同器官中的表达谱,转化获得了该基因组成型过量表达的油菜转基因植株36株,从而为后续研究打下了良好基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 硼在植物体中的生理功能
• 2 植物对硼的吸收和转运
• 2.1 硼的跨膜运输
• 2.2 硼的木质部和韧皮部运输
• 3 植物对硼逆境耐性的基因工程
• 3.1 植物对缺硼耐性的基因工程
• 3.2 植物对硼毒害的耐性及其遗传调控
• 4 本项研究的内容和目的意义
• 第二章 甘蓝型油菜硼转运蛋白基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和培养基
• 1.1.3 酶和其他化学试剂
• 1.2 主要方法
• 1.2.1 RT-PCR方法克隆油菜硼转运蛋白基因
• 1.2.2 油菜硼转运蛋白基因gDNA的获得
• 1.2.3 与载体连接并转化大肠杆菌
• 1.2.4 阳性克隆的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 油菜根系总RNA的提取
• 2.2 油菜硼转运蛋白基因的RT-PCR扩增
• 2.3 pMD-BnBOR质粒DNA检测
• 2.4 油菜硼转运蛋白基因gDNA的PCR扩增及重组质粒检测
• 2.5 油菜硼转运蛋白基因测序结果
• 3 讨论
• 第三章 油菜硼转运蛋白基因的生物信息学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 分析结果
• 2.1 BnBOR蛋白理化性质的预测
• 2.2 BnBOR蛋白疏水性轮廓分析
• 2.3 BnBOR蛋白功能结构域分析结果
• 2.4 BnBOR与其他物种硼转运蛋白基因的同源性比较和系统发育分析
• 3 讨论
• 第四章 油菜硼转运蛋白基因拷贝数和在不同器官中的表达谱分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 酶和其他化学试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 油菜硼转运蛋白基因拷贝数分析
• 1.2.2 油菜硼转运蛋白基因在不同器官中的表达谱分析
• 2 结果与分析
• 2.1 甘蓝型油菜硼转运蛋白基因的Southern杂交分析
• 2.2 油菜不同器官中硼转运蛋白基因的RT-PCR分析
• 3 讨论
• 第五章 油菜硼转运蛋白基因过量表达载体的构建及其遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌株和质粒
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 pFGC-5941-BnBOR植物表达载体的构建
• 1.2.2 农杆菌介导油菜转化
• 1.2.3 转化植株PCR检测
• 2 结果与分析
• 2.1 油菜硼转运蛋白基因过量表达载体的构建
• 2.2 pFGC-5941-BnBOR质粒DNA检测
• 2.3 转化植株的获得及其PCR检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文