论文摘要
盐害是影响农作物正常生长发育及产量形成的主要逆境因子之一,随着生态环境的日益恶化,土壤盐渍化面积不断增加,对作物的生产造成严重危害。小麦是世界上最重要的粮食作物之一,开展小麦耐盐机制的研究、耐盐基因的分离和耐盐新品种的选育,对于扩大小麦种植面积、提高单位面积产量、保障粮食安全具有重要意义。本研究在实验室前期工作积累的基础上,从山融3号和济南177盐胁迫后根部抑制性差减cDNA文库基因表达谱芯片中,通过对差异基因的功能预测,发现了一些潜在的耐盐候选基因。本实验选取在氯化钠处理后表达有大幅度下调的TaACO1及TaSTPK基因为研究对象,对其进行了克隆、亚细胞定位、表达模式分析、异源表达和基因功能的验证,并对两个基因转化拟南芥获得的纯合株系的生理性状进行了鉴定,明确了目的基因的生理功能及其参与盐胁迫的逆境响应机理。取得的主要结果如下: 1、TaACO1的克隆与功能分析成功克隆了山融3号盐胁迫响应基因TaACO1的ORF序列和基因组全长序列,该基因的ORF序列由942个碱基对组成,基因组序列由4个外显子和3个内含子构成。从山融3号和济南177中克隆到的该基因序列是一致的,表明山融3号的ACO1基因来源于济南177。该基因的氨基酸序列与水稻中的一个ACC氧化酶基因的序列同源性高达80%以上,同玉米中的两个ACC氧化酶基因的同源性也达到了60%以上,而与拟南芥、西红柿中的ACC氧化酶基因的同源性相对较低,约为40%左右。利用200 mM NaCl、100 mM H2O2处理山融3号和济南177时,RT-PCR的结果表明该基因呈下调表达,这与cDNA芯片的数据一致,说明该基因可能参与了逆境胁迫响应;利用100μM ACC处理时该基因则表现上调表达,可能原因在于ACC是ACC氧化酶的底物,过量的底物诱导了ACC氧化酶的表达。利用亚细胞定位载体TaACO1-GFP对该基因在小麦原生质体中进行定位发现,该基因在细胞质中有表达。利用pET-30a原核表达载体将该基因在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中异源表达,发现重组蛋白在上清与沉淀中均有表达,上清过镍柱纯化,纯化的重组蛋白与ACC氧化酶活性测定液反应后产生的气体,使用气相色谱仪检测后发现,它们与标准乙烯气体有相同的峰值。推断TaACO1基因的蛋白产物确实有ACC氧化酶功能,该基因应该是小麦中的一个ACC氧化酶基因,可以催化ACC产生乙烯。植物体内的乙烯含量的升高,可以促进下胚轴的伸长,利用pSTART构建过表达载体并转化拟南芥,筛选、鉴定并获得纯合株系,其种子在1/2 MS培养基上萌发后在弱光照条件下生长10天左右,其下胚轴的长度明显长于空载体和野生型植株对照,证明TaACO1的过量表达产生更多的乙烯促进了下胚轴的伸长。2、TaSTPK的克隆与功能分析在山融3号和济南177中克隆到了一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因,该基因ORF由1485个碱基对组成,山融3号与济南177中的序列有5个碱基对及4个氨基酸的差异,该基因的基因组序列由6个外显子和5个内含子组成。利用200 mM NaCl、100 mM H2O2处理山融3号和济南177后,RT-PCR的结果表明该基因均呈下调表达,说明该基因参与了植物逆境胁迫响应过程。亚细胞定位结果显示,TaSTPK基因在细胞质和细胞核中均有表达。该基因的纯合过表达拟南芥株系的种子在盐处理条件下萌发早于空载体对照,且100 mM NaCl处理条件下萌发率明显高于后者,表明该基因在盐胁迫条件下种子萌发的过程中起作用。在大肠杆菌BL21（DE3）菌株中异源表达发现重组蛋白主要在包涵体中表达,由于包涵体的复性非常复杂且复性的效率较低,重组蛋白的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性未检测到。通过对两个基因的分析,明确了其序列结构特点、胁迫条件下表达模式的变化,对其功能进行了初步的探讨,证明两个基因在盐胁迫响应的信号通路中起作用,为小麦的耐盐机制的研究提供了参考依据。3.蚕豆保卫细胞质膜钙离子通道的电生理记录、鉴定及分析本部分实验以Ca2+为通透离子,对蚕豆保卫细胞质膜电压依赖的Ca2+通道进行了记录及分析,以Gd3+作为抑制剂的研究结果显示记录的电流信号是Ca2+通透形成的。但电流的逆转电位分析则显示与理论的Ca2+平衡电位差距很大,进一步的研究结果发现,胞质的K+浓度是影响电流逆转电位的重要的因素,表明该类电压依赖的Ca2+通道可以介导K+的外流,同时发现质膜上还存在有同样通透特性的大电导的电压依赖的Ca2+通道,推测可能与保卫细胞区域性的钙离子浓度升高并在气孔的快速关闭中起作用。该研究结果是首次在保卫细胞中发现电压依赖的Ca2+通道外向通透K+,对于指导植物特异性的电压依赖的钙离子通道具有重要意义。