基于锚定RT-PCR的青蒿EST克隆、测序及生物信息学分析

论文摘要

随着人类基因组计划和水稻基因组计划两大里程碑式的生物微观世界探索工程的相继胜利完成，当今分子生物学研究已步入基因组学的新时代。可是，在传统抗疟中药青蒿中，迄今尚未开展大规模基因组测序工作，严重制约了青蒿素基因工程改良的研究进展。为了跟上时代发展的步伐，本研究利用以锚定逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）为依托的转录物组学技术平台，以盛花期青蒿为材料开展全景式cDNA文库构建工作，结果共获得93个cDNA克隆并完成了序列测定。经过软件分析和序列比对，对54个cDNA序列进行了功能注释，包括青蒿中有测序记录的同种基因1个，其他植物中有测序记录的同源基因33个，无任何测序记录的新基因20个，其中有20个注释序列已在全球共享公共基因数据库GenBank上公布，另有34个未注释序列也以表达序列标签（EST）形式打包提交，即将公布。在此基础上，我们依据同源性比较原理，进一步开展了青蒿基因的虚拟定位、克隆归类和分子进化等生物信息学分析。通过这些研究，已在水稻基因组中找到39条与青蒿基因高度同源的祖先序列，并由此绘制出基于比较基因组学的青蒿染色体图谱。同时，利用青蒿细胞色素P450还原酶（CPR）基因和18SrRNA基因，通过估算其分子进化距离，构筑了包含多个植物种属的最大简约化系统树，从而拓展了植物分子分类学的研究领域。此外，以本实验室及国内外研究机构所获青蒿基因组学成果为契机，还筹建了一个将向全球开放供免费浏览的青蒿素高级专业网站——青蒿素在线（ArteLine）。本研究丰富了可利用的青蒿基因资源，必将促进青蒿及其他植物的基因组学研究及基因克隆与鉴定，有助于青蒿基因图谱的构建以至全基因组序列的最终破译，也为今后利用遗传操作技术在体内外重建青蒿素合成途径及开展青蒿素代谢途径工程研究奠定扎实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 正文
• 第一章 综述
• 1.1 EST的概念及技术原理
• 1.2 EST技术在结构基因组学中的应用
• 1.2.1 基因标记
• 1.2.2 基因作图
• 1.2.3 电子克隆
• 1.3 EST技术在功能基因组学中的应用
• 1.3.1 基因表达研究
• 1.3.2 比较基因组学
• 1.3.3 蛋白质组学
• 1.3.4 基因芯片技术
• 1.4 存在的问题及其对策
• 1.5 本研究立项依据及意义
• 第二章 基于锚定RT-PCR的青蒿EST克隆和测序
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 扩增引物
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 RNA分离与引物去除
• 2.2.2 cDNA合成及产物纯化
• 2.2.3 末端加尾与纯化
• 2.2.4 PCR扩增
• 2.2.5 片段回收
• 2.2.6 酶切与连接
• 2.2.7 大肠杆菌转化
• 2.2.8 重组质粒鉴定
• 2.2.9 cDNA测序
• 2.3 结果
• 2.3.1 总 RNA的质量控制
• 2.3.2 cDNA扩增产物
• 2.3.3 转化菌落的筛选
• 2.3.4 重组质粒的鉴定
• 2.3.5 青蒿cDNA测序
• 2.4 讨论
• 第三章 青蒿EST序列分析及功能注释
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 序列整理
• 3.2.2 载体序列甄别
• 3.2.3 同一性检查
• 3.2.4 同源性比较
• 3.2.5 序列命名
• 3.2.6 序列提交
• 3.3 结果
• 3.3.1 青蒿cDNA序列分拣
• 3.3.2 青蒿cDNA序列重叠分析
• 3.3.3 青蒿cDNA序列同源性比较
• 3.3.4 青蒿cDNA序列发布
• 3.4 讨论
• 第四章 青蒿EST序列的比较基因组学定位
• 4.1 材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 未注释序列的比较基因组作图
• 4.2.2 已注释序列的比较基因组作图
• 4.2.3 UbiGene识别
• 4.2.4 植物系统树构建
• 4.3 结果
• 4.3.1 青蒿未注释序列的比较基因组图谱
• 4.3.2 青蒿已注释序列的比较基因组图谱
• 4.3.3 青蒿基因的UniGene归类
• 4.3.4 基于编码基因的植物分子进化树
• 4.3.5 基于非编码基因的植物分子进化树
• 4.4 讨论
• 第五章 青蒿素在线（ArtLine）:全球可浏览青蒿素网站
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 支持软件
• 5.2.2 编辑流程、超链接和上传
• 5.3 结果
• 5.3.1 栏目设置
• 5.3.2 首页
• 5.3.3 关于我们
• 5.3.4 科学博客
• 5.3.5 相关链接
• 5.4 讨论
• 结语
• 参考文献
• 致谢