论文摘要
目的:线粒体功能障碍在代谢综合征、肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等多种胰岛素抵抗相关性疾病当中已经得到证实,并且被认为是疾病发病机理和进程中的重要作用因子。当线粒体功能障碍在糖尿病中得到愈来愈深入研究的同时,另外一个至关重要的角色——非酯化脂肪酸（nonesterified fatty acid, NEFA）以及脂肪酸代谢物,也因为日益增多的证据而成为研究的重点。NEFA可以通过改变基因表达、新陈代谢、或/和线粒体Ca2+([Ca2+]m)动态稳定来影响线粒体功能。本研究小组先前已证实了多聚不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFA）诱导的线粒体Ca2+流出,一种耗竭[Ca2+]m的行为,正是这种行为导致了线粒体的功能障碍。本研究旨在探讨PUFA所介导的线粒体Ca2+的流出(PUFA-induced mitochondrial Ca2+ efflux, PIMCE)这一过程的机制,以及通路中可能参与的分子实体,为阐明脂毒性的作用机制和PUFA引发线粒体功能障碍的机制提供理论依据。方法:从大鼠的不同组织中提取线粒体,利用荧光探针标记技术检测PIMCE效应。根据不同组织PIMCE效应的差异,设计对照试验,利用蛋白质组学研究线粒体蛋白在特定条件和环境下的表达差异。诱导人畸胎癌NT2细胞分化为神经样细胞,利用双向凝胶电泳（2-dimensionalgel elecrophoresis）对NT2细胞和诱导分化后细胞的线粒体蛋白进行分析,选取表达水平有明显改变的蛋白点位,利用毛细管-高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析法对兴趣蛋白点位进行分析,确定蛋白分子身份。根据蛋白分子身份,选取适宜的药理学抑制剂和RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术,利用Ca2+测定、荧光标记和激光共聚焦技术,观察对NT2细胞PIMCE的影响作用,确定该蛋白分子在PIMCE通路中的作用。同时利用蛋白免疫印迹法（western blot）和免疫荧光法（immunofluorescence）确定该蛋白在线粒体中的分布定位。所有数据用均数±标准差的形式表示。采用成组t检验或方差分析对样品进行统计分析,p<0.05有统计学意义。结果:1.不同组织来源的线粒体的PIMCE效应存在差异,脑组织中线粒体的PIMCE效应较其他组织的显著减弱（p<0.01, liver vs brain, n=6）。2.用维甲酸（retinoic acid, RA）诱导NT2细胞分化成神经样细胞后,PIMCE也随之减弱。利用双向凝胶电泳对NT2细胞和诱导分化后细胞的线粒体蛋白进行分析,结果显示RA诱导分化后的细胞中多个蛋白质点位的表达水平明显减少。利用毛细管-高效液相色谱-电喷雾串联质谱分析法对3个兴趣蛋白点位进行分析,确定这些蛋白分别是:热休克蛋白90β1（heat shock protein 90β1,HSP90β1）,即gp96同系物,也被称为糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94,GRP94）和肿瘤排斥抗原1（tumor rejection antigen 1, TRA1）;150kD氧调节蛋白变异体1（oxygen-regulated protein variant 1）;富含亮氨酸的PPR基序含有蛋白,或结节调质2同工型2。经文献检索和分析,最终锁定HSP90β1。3.用HSP90β1的抑制剂17-（dimethylaminoethylamino）-17-demethoxygeldanamycin （17-DMAG）和HSP90β1 RNAi两种方法都可以显著减弱NT2细胞的PIMCE（p<0.01 vs control, n=4）。4.利用蛋白免疫印迹法（p<0.05 vs control,n=4）和免疫荧光法进行双色荧光标记（p<0.001 vs control,n=27）,结果显示HSP90β1在线粒体上确有分布,并且17-DMAG或HSP90β1 RNAi显著减少的NT2细胞线粒体上HSP90β1蛋白表达。5.急性作用时,N-末端抑制剂17-DMAG对PIMCE没有影响,而HSP90β1的C-末端抑制剂新生霉素（novobiocin）可以显著抑制PIMCE（p<0.02,novobiocin vs control,n=4）。结论:通过目前的研究,我们已经确认在LA介导的线粒体Ca2+外流中,HSP90β1有着重要作用。2型糖尿病中NEFA的升高可以导致线粒体Ca2+内稳态的改变和线粒体功能障碍,而在这一过程当中,早已广为人知的“伴娘”分子HSP90β1则在PIMCE效应中具有新奇而又重要的作用,并且HSP90β1的C-末端在PIMCE中扮演着更至关重要的角色。我们的研究提示:在PIMCE中,HSP90β1扮演着重要角色,并且在与高NEFA相关的线粒体功能障碍疾病中,HSP90β1可能成为一个潜在的新型的治疗靶向。
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标签：多聚不饱和脂肪酸论文; 线粒体论文; 钙离子论文; 热休克蛋白论文;