论文摘要
蓖麻毒素（ricin）,又称为蓖麻毒蛋白。由A和B两条多肽链组成,其间通过二硫键相连接。A链（ricin A chain, RTA）是活性链,具有N-糖苷酶活性,可催化真核细胞核糖体28S rRNA第4324位腺嘌呤发生脱嘌呤作用,从而抑制蛋白质的合成。B链（ricin B chain, RTB）具有凝集素活性,能够识别和结合细胞表面末端含有半乳糖结构的受体,并协助A链进入细胞。一个毒素分子进入细胞内,就足以使整个细胞的蛋白质合成完全停止而死亡。一般认为,蓖麻毒素进入细胞涉及到一系列的步骤:1、通过B链与细胞表面含有β-1,4糖苷残基的糖蛋白和糖脂结合;2、通过内吞进入细胞;3、进入早期内涵体;4、通过囊泡转运,毒素进入高尔基体反式外侧网络（TGN）;5、逆向转运进入内质网;6、RTA和RTB间的二硫键断裂;7、部分展开折叠的RTA通过Sec61p易位子穿过内质网膜;7与核糖体相互作用,催化脱嘌呤作用。近期研究表明,由于蓖麻毒素没有专一性的受体,故毒素可能通过多种途径进入细胞内,而且在细胞中的逆向转运的各个过程中,可能也存在不止一种机制起作用。本研究利用经典的MTS检测、免疫共沉淀和RNAi等技术研究了α甘露糖苷酶样内质网降解增强蛋白2（ER degradation enhancingα–mannosidase-like protein,EDEM2）、ADP-糖基化因子相关蛋白1（ADP-ribosylation factor-related protein 1,ARFRP1）和ERp29对于蓖麻毒素在细胞内逆向转运过程中的作用。通过研究我们发现:过量表达EDEM2后提高了细胞对蓖麻毒素的抵抗能力,检测发现细胞的蓖麻毒素的总量并没有改变。细胞转染EDEM2后,用嘌呤霉素处理的细胞对蓖麻毒素的敏感性明显提高。免疫共沉淀结果显示,嘌呤霉素处理后,更多的蓖麻毒素与EDEM2发生作用,也有更多的蓖麻毒素通过Sec61p蛋白通道进入胞浆。Kifunensine抑制EDEM2与错误折叠蛋白的作用后,显著地提高了蓖麻毒素A链的逆向转运。免疫共沉淀证明,kifunensine能够显著提高蓖麻毒素与EDEM2以及蓖麻毒素与Sec61α的相互作用。转染ARFRP1（wt）和ARFRP1（Q97/L）后,细胞对毒素的敏感性明显增强,转染ARFRP1（T31/N）后,细胞抵抗毒素的能力有一定的提高。同时,转染后的细胞中蓖麻毒素的总量没有明显变化。用BFA处理细胞后,蓖麻毒素对细胞的毒性显著降低,但转染ARFRP1和ARFRP1（Q97/L）的细胞对毒素的敏感性依然较高。转染后的细胞加入蓖麻毒素后低温诱导培养24h后,细胞毒性检测结果表明。低温诱导对表达ARFRP1和ARFRP1（T31/N）的细胞影响更大。过量表达ERp29蛋白后,CHO-K1细胞对蓖麻毒素的敏感性明显提高,内质网中糖基化的蓖麻毒素A链明显增加。而抑制细胞内ERp29蛋白的表达后,细胞抵抗蓖麻毒素的能力升高,与对照细胞相比,进入内质网的糖基化的蓖麻毒素的量相对减少。免疫共沉淀结果显示,过量表达ERp29蛋白后,有更多的蓖麻毒素与Sec61α相互作用,而干扰ERp29蛋白表达后,与Sec61α作用的蓖麻毒素相应减少。本研究首次证实EDEM2、ARFRP1及ERp29影响蓖麻毒素细胞内转运过程,尤其是国内外迄今仍未见有过ERp29参与蛋白质毒素逆向转运的相关报道。