耐辐射菌株WGR700、WGR702的分离鉴定及耐辐射特性初步研究

论文摘要

核工业和核试验产生的大量放射性废物,可能导致严重的环境污染。开发耐辐射微生物菌株资源并研究其耐辐射的机制,不仅对阐明DNA损伤修复分子机理,而且在环境保护和生物修复、人类健康,乃至地外空间的开发和利用等方面均有十分重要意义。本实验从广西大学辐射中心多年间断受60Co辐射(0.1 kGyh-1)污染的水样和土壤中各分离得到一株新的耐辐射菌株WGR700和WGR702。经检测菌株WGR700和WGR702分别为革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性球菌;最适生长温度分别为37℃和28～32℃;（G+C）mol%含量分别为64.7mol%和60.5mol%。UV和γ射线辐射抗性试验表明菌株WGR700和WGR702都具有很强的辐射抗性。γ射线辐射下菌株WGR700和WGR702的D10（10%生存率时的辐射剂量）分别为9.8 kGy和7.1 kGy。16S rDNA序列分析表明,菌株WGR700的16S rDNA（NCBI序列号:EU285374）与奇异球菌属（Deinococcus）已报道菌株16S rDNA序列相似性最高,达到87.5%～95.6%。菌株WGR702的16S rDNA（NCBI序列号:EU315117）则与沙雷氏菌属（serratia）菌株16S rDNA序列有非常高的相似性,达到94.8%～98.5%。通过对菌株WGR700和WGR702的16S rDNA序列进行测定和分析,结合电离辐射抗性试验和表型及生理生化各个方面的鉴定结果,最后确定了菌株WGR700为奇异球菌属的一个新种,命名为Deinococcus guangxiensissp.nov。菌株WGR702的鉴定结果表明其可能为沙雷氏菌属中具有耐辐射特性的一个新种。比较了不同剂量的γ射线辐射对耐辐射菌株WGR700、D.radioduransR1和辐射敏感菌株E.coli DH5α细胞可溶性蛋白含量变化的影响,结果表明耐辐射菌株与辐射敏感菌株细胞可溶性蛋白质含量变化不同。耐辐射菌株WGR700和WGR702的分离鉴定及若干特征的研究对进一步克隆耐辐射基因,了解耐辐射菌株的耐辐射机制具有一定的意义和价值。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 极端环境下的微生物
• 1.2 耐辐射微生物
• 1.2.1 耐辐射微生物的起源进化
• 1.2.2 耐辐射微生物的分离及多样性
• 1.3 耐辐射机理相关研究进展
• 1.3.1 耐辐射奇异球菌
• 1.3.2 耐辐射奇异球菌的电离辐射抗性
• 1.3.3 化学诱变剂、UV和电离辐射所致的DNA损伤类型
• 1.3.4 耐辐射菌株特殊细胞壁结构的研究
• 1.3.5 损伤修复类型
• 1.3.6 耐辐射菌株中保护酶相关的研究
• 1.3.7 耐辐射菌株在基因工程中的应用研究
• 1.4 耐辐射菌株基因组学研究
• 1.5 展望
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.2 培养基、抗生素及培养条件
• 2.2.1 培养基
• 2.2.2 抗生素
• 2.2.3 培养条件
• 2.2.4 菌体保存
• 2.3 常用溶液、缓冲液和试剂
• 2.4 所用仪器
• 2.5 菌株的分离与纯化
• 2.6 菌株形态学和生理生化测定
• 2.6.1 菌株生长条件检测
• 2.6.2 菌株生长曲线的测定
• 2.6.3 革兰氏染色和显微镜观察
• 2.6.4 电镜和显微镜检测
• 2.6.5 氧化酶试验
• 2.6.6 接触酶试验
• 2.6.7 精氨酸双水解酶试验
• 2.6.8 脲酶检测
• 2.6.9 淀粉水解检测
• 2.6.10 反硝化试验
• 2.6.11 明胶液化检测
• 2.6.12 抗生素敏感性试验
• 2.6.13 甲基红试验及V-P测定
• 2.6.14 糖、醇类发酵
• 2.6.15 七叶灵水解
• 2.6.16 碳源利用
• 2.6.17 氮源利用
• 2.7 G+C mol%含量测定
• 2.7.1 基因组DNA的大量制备及纯化
• 2.7.2 Tm测定及G+C mol%含量计算
• 2.8 分子生物学鉴定
• 2.8.1 染色体总DNA少量提取
• 2.8.2 琼脂糖核酸凝胶电泳
• 2.8.3 PCR扩增DNA片段
• 2.8.4 试剂盒法快速回收DNA片段
• 2.8.5 DNA连接
• 2.8.6 快速制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.8.7 质粒DNA的电脉冲导入
• 2.8.9 质粒DNA的提取:快速碱裂解法
• 2.8.10 DNA的限制性内切酶酶切
• 2.8.11 PCR反应验证
• 2.9 蛋白质浓度标准曲线的绘制
• 第三章 耐辐射菌株WGR700和WGR702的分离与鉴定
• 3.1 菌株WGR700和WGR702的分离与纯化
• 3.2 革兰氏染色结果
• 3.3 菌株形态观察
• 3.4 生理生化实验结果
• 3.4.1 菌株最适生长条件及耐盐性检测
• 3.4.2 菌株生长曲线测定
• 3.4.3 WGR700生理生化实验结果
• 3.4.4 WGR702生理生化实验结果
• 3.5 G+C mol%含量
• 3.6 WGR700全细胞脂肪酸含量测定
• 3.7 分子生物学鉴定
• 3.7.1 16S rDNA序列扩增
• 3.7.2 16S rDNA序列分析
• 3.8 小结
• 第四章 菌株WGR700和WGR702耐辐射特性初步研究
• 4.1 菌株WGR700和WGR702 UV辐射抗性检测
• 4.2 菌株WGR700和WGR702γ射线辐射抗性检测
• 60Co辐射对菌株WGR700、D.radiodurans R1和E.coli DH5α细胞可溶性蛋白含量影响'>4.3⁶⁰Co辐射对菌株WGR700、D.radiodurans R1和E.coli DH5α细胞可溶性蛋白含量影响
• 60Co辐射'>4.3.1 菌株准备及⁶⁰Co辐射
• 4.3.2 细胞蛋白质浓度的测定
• 4.4 小结
• 4.4.1 辐射抗性检测结果
• 60Co辐射对菌株WGR700、D.radiodurans R1和E.coli DH5α细胞可溶性蛋白含量变化影响'>4.4.2⁶⁰Co辐射对菌株WGR700、D.radiodurans R1和E.coli DH5α细胞可溶性蛋白含量变化影响
• 第五章 总结与讨论
• 5.1 菌株WGR700的分离鉴定
• 5.2 菌株WGR702的分离鉴定
• 5.3 菌株WGR700和WGR702 UV及γ射线辐射抗性检测
• 60Co辐射对菌株WGR700、D.radiodurans R1和E.coli DH5α细胞可溶性蛋白含量变化影响分析'>5.4⁶⁰Co辐射对菌株WGR700、D.radiodurans R1和E.coli DH5α细胞可溶性蛋白含量变化影响分析
• 5.5 工作小结与后续工作
• 5.5.1 工作小结
• 5.5.2 后续工作
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文