天然产物D5、S3及其衍生物抗肿瘤活性的初步研究

论文摘要

本论文从抗肿瘤活性化合物D5出发,通过MTT法确定其敏感细胞株,并对其同系物和衍生物进行了抗肿瘤活性测定;采用荧光滴定法对D5的疑似靶蛋白TR3的相互作用进行了初步研究,采用正交试验对TR3的表达条件进行了优化,并得到了TR3的晶体。此外,采用MTT法对S3的抗肿瘤活性进行研究,并对S3及其衍生物SA-1进行体外抗肿瘤活性的对比。采用流式细胞仪分析技术,研究化合物S3以及SA-1对ROS含量、细胞周期的影响。在此基础上,对化合物S3的作用机制以及急性毒性进行了初步研究。通过以上研究,获得了一些有意义的结果:1、采用MTT法对化合物D5的体外抗肿瘤活性进行了初步研究。选用9株人源、鼠源的细胞株对D5的细胞毒活性进行测定,结果表明化合物D5对细胞的抑制作用具有特异性。在所选的5株肿瘤细胞株中,人胃癌细胞BGC-823对D5最为敏感,其IC50为3.550μg/mL,而化合物D5对正常细胞HL7702、Aml-12等细胞的毒性小于阳性对照。2、对GST-TR3（LBD）融合蛋白进行体外异源表达,采用荧光滴定方法检测化合物D5与其疑似靶蛋白TR3（LBD）的相互作用。首先,在优化并确定M9培养基成分的基础上,采用4因素3水平的正交试验对表达条件进行优化,得出IPTG浓度以及诱导前菌浓是影响目的蛋白表达量的最关键因素,其中IPTG的最佳浓度确定为0.3mmol/L,最佳菌浓对应OD600约为0.77,在此条件下蛋白表达量优化达到2.0mg/L（与LB培养基产量近似）。荧光滴定实验结果表明,化合物D5与TR3有较强的相互作用,二者的结合常数约为2.30×109。3、采用MTT法对通过化学合成得到的D5的49个衍生物（包括Zhn、Lix、Wi以及Lwj等系列）进行了抗肿瘤活性测定。以Zhn89（化学合成的D5）为对照,经过体外抗肿瘤活性的初步筛选,从49个化合物中筛选出10个活性较强的化合物。以啤酒酵母、白色假丝酵母为指示菌,对以上11个化合物（包括D5）以及苯环上带有三羟基的6个化合物进行抗真菌活性测定,结果表明,化合物D5、Zhn89、Zhn111、Zhn196a、Lwj126以及Wj94对啤酒酵母有较强的抑制作用,其MIC为100μM～140μM;仅有D5对白色假丝酵母有抑制活性,其MIC为100μM。4、选用10株人源、鼠源的细胞株对S3的细胞毒活性进行测定,研究结果表明,该化合物对细胞的抑制作用具有特异性。在所选7株肿瘤细胞株中,人子宫颈癌细胞Hela对S3最为敏感,其IC50为1.275μg/mL。化合物S3对正常细胞HL-7702、Aml-12等的细胞毒性略低于阳性对照。5、通过形态观察、DAPI核染色、流式细胞仪检测以及Western blotting等分析方法对S3的作用机理进行了初步研究,发现该化合物可以诱导Hela细胞凋亡。急性毒性实验表明其LD50大于2000mg/kg体重,属低毒化合物,具有进一步开发研究的价值。6、化合物SA-1是S3的衍生物,MTT法测定结果表明二者对Hela细胞均有抑制活性。ROS细胞水平检测结果表明SA-1能显著增加ROS的含量,而S3的作用则不明显。在SA-1作用下,细胞周期分析中没有明显的凋亡峰出现,化合物SA-1抑制细胞的方式可能是引起细胞坏死。本文研究结果表明,天然产物D5以及S3均有较好的生物活性,对其衍生物的研究则发现化合物的结构与其活性密切相关,结构改造是开发高效、低毒抗肿瘤新药的有效途径。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1.抗肿瘤药物的研究进展
• 1.1 代表性抗肿瘤天然药物研究进展
• 1.1.1 紫杉醇
• 1.1.2 喜树碱
• 1.2 化合物D5、S3简介
• 1.3 药物诱导肿瘤细胞死亡的方式
• 1.4 肿瘤细胞凋亡的调节
• 1.4.1 肿瘤细胞凋亡的主要调节因子
• 1.4.2 核受体家族与肿瘤细胞的相关性
• 1.4.3 TR3研究情况
• 1.5 抗肿瘤药物开发新策略
• 2.本课题研究目的、内容和意义
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 结果与分析
• 1.化合物D5及其衍生物抗肿瘤活性研究
• 1.1 化合物D5的细胞毒活性
• 1.1.1 D5对5株肿瘤细胞株的细胞毒作用
• 1.1.2 D5对4株正常细胞株的细胞毒作用
• 50'>1.1.3 D5对9株细胞株作用的IC₅₀
• 1.2 人工合成D5及其衍生物活性研究
• 1.2.1 化合物D5以及Zhn-89体外抗肿瘤活性研究
• 1.2.2 D5衍生物抗肿瘤活性
• 1.3 抗真菌活性研究
• 1.4 D5与TPO（LBD）相互作用
• 1.4.1 TR3表达条件优化
• 1.4.2 TR3的纯化、保存
• 1.4.3 化合物D5与TR3（LBD）相互作用
• 2.化合物S3抗肿瘤活性的研究
• 2.1 化合物S3的细胞毒活性
• 2.1.1 S3对7株肿瘤细胞株的细胞毒作用
• 2.1.2 S3对3株正常细胞株的细胞毒作用
• 50'>2.1.3 S3对10株细胞株作用的IC₅₀
• 2.2 化合物S3与SA-1的活性对比
• 2.2.1 S3、SA-1对细胞存活率的影响
• 2.2.2 SA-1的体外细胞毒活性
• 2.2.3 S3以及SA-1对细胞活性氧含量的影响
• 2.2.4 SA-1对细胞周期的影响
• 2.3 化合物S3抑瘤机理的初步研究
• 2.3.1 S3对细胞形态的影响
• 2.3.2 S3引起细胞死亡的方式
• 2.3.3 S3对细胞骨架蛋白的影响
• 2.3.4 S3对细胞周期的影响
• 2.3.5 S3对Bax基因表达量的影响
• 2.4 化合物S3药理初步研究
• 讨论与结论
• 1.天然产物抗肿瘤活性研究
• 1.1 化合物D5及其衍生物的抗肿瘤活性
• 1.2 化合物D5与孤身受体TR3的相互作用
• 1.2.1 表达条件对GST-TR3产量的影响
• 1.2.2 化合物D5与TR3的相互作用
• 1.3 化合物S3的抗肿瘤活性以及急性毒性实验
• 2.化合物构效关系研究
• 2.1 化合物D5、S3与其衍生物的抗癌活性对比
• 2.2 筛选抗肿瘤化合物的思路
• 3.结论与展望
• 参考文献
• 致谢