论文摘要
缺血性心脏病（IHD）是由于冠状动脉循环改变引起冠状血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害,其发病率高,死亡率高,严重危害着人类的身体健康。IHD的主要病理改变是不可逆性功能心肌细胞丢失,梗死区被纤维疤痕替代,以及残余心肌发生心室重构,进而发展为充血性心力衰竭。目前的药物治疗、介入治疗及冠脉旁路手术能够改善心肌缺血,但仍然不能逆转已经坏死的心肌,更不能促进心肌细胞的再生。治疗性血管发生（therapeutic angiogenesis）根据血管生成的机制,用人工干预的手段刺激心肌缺血区小血管生长和侧支循环形成,从而修复与再生坏死心肌细胞,阻止或延缓心室重构和心功能衰竭,是当前治疗缺血性心肌病的研究热点。目前治疗性血管发生可通过三种方法得以实现:生长因子蛋白治疗,细胞移植以及基因治疗。缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α）是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白,不仅可以结合多种促血管因子如血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）等及其受体基因启动子上的缺氧反应元件,从而增强相应蛋白的表达,启动血管新生过程,提高血流灌注,挽救濒死缺氧的心肌细胞,还可以提高缺血心肌对缺氧环境的适应性,增强酵解过程,为心肌提供更多的能量代谢,可以设想,HIF-1α用于基因治疗具有两大优势:1.作为上游调控基因将比VEGF、ANG-2等单纯基因治疗更具效率;2.HIF-1α在常氧条件下迅速降解,具有可控性,减低了VEGF持续高表达诱发血管瘤的危险性。骨髓间充质干细胞（MSCs）具有分化为心肌细胞、内皮细胞的多向分化潜能,且分离方便、增殖容易、遗传稳定、无免疫排斥和伦理障碍等优势,是干细胞治疗的理想供体细胞。由此,假设将转染HIF-1α基因的MSCs移植到心梗区,以求基因和细胞治疗相互协同、相互促进,能同时、更好地实现心肌再生和血管发生,是一种极具潜能的替代疗法。因此,本研究拟在大鼠的心肌缺血的模型上,通过移植体外转染HIF-1α基因的MSCs,探求这种方法对IHD的治疗效果,为进一步的临床应用提供铺垫性实验依据。本实验共分为三部分:第一部分HIF-1α基因克隆及HIF-1α-pcDNA3.1载体的构建目的:构建并鉴定HIF-1α真核表达载体HIF-1α-pcDNA3.1方法:抽提大鼠心肌细胞mRNA,以mRNA为模版,逆转录得到cDNA,PCR扩增HIF-1α目的基因,连接到pGEM-T载体中,酶切,测序证实,双酶切将HIF-1α转至pcDNA3.1中。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR扩增出的特异片段约2480bp,基因测序结果与GenBank报道的完全一致,成功构建了HIF-1α-pcDNA3.1真核表达载体。第二部分HIF-1α基因转染骨髓间充质干细胞及其表达目的:研究HIF-1α真核表达载体HIF-1α-pcDNA3.1体外转染MSCs及HIF-1α基因在MSCs中的表达情况。方法:采用密度梯度离心—贴壁培养法获Wistar大鼠MSCs。对其进行表型及生长曲线测定,并进行向成骨细胞及脂肪细胞诱导分化的研究。采用脂质体介导技术将HIF-1α-pcDNA3.1转染至MSCs,在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过RT-PCR,Western和ELISA鉴定HIF-1α在细胞中的表达情况。结果:1.采用Percoll密度梯度离心-贴壁培养法易获取大鼠MSCs,形态学观察呈纤维样细胞外观;免疫组化检测结果为CD44、SH3（CD73）阳性,CD34、CD45阴性,符合MSCs表面标记;流式细胞仪分析,CD44、SH3（CD73）阳性细胞分别占94.7%、97.3%,表明分离培养的MSCs纯度较高;经诱导后,所培养的MSCs可成功向成骨细胞及脂肪细胞分化。2.RT-PCR证实采用阳离子脂质体Lipofectamine2000转染的MSCs表达HIF-1αmRNA明显增加,Western和ELISA检测证实转基因MSCs表达HIF-1α蛋白明显增加。第三部分HIF-1α转染骨髓间充质干细胞移植对大鼠心功能的影响目的:利用冠脉结扎法构建Wistar大鼠心肌缺血动物模型,探讨HIF-1α基因转染MSCs后心肌移植对缺血性心脏病心功能及心室重构的影响,并比较联合治疗与基因治疗、细胞治疗的疗效差别。方法:80只Wistar近交系大鼠随机分为5组（各组16只）,首先结扎前降支,2周后形成慢性心肌缺血动物模型。A组于心梗区移植转HIF-1α的MSCs（联合组）,B组单纯移植等量的MSCs（细胞组）,C组单纯注射HIF-1α-pcDNA3.1复合物（基因组）,D组注射无血清培养液（对照组）,E组仅用于模型评估（评估组）。另取16只未结扎冠脉的Wistar近交系大鼠为假手术组,亦未作任何治疗,设为F组。移植4周后以Buxco系统检测心功能,测量心梗面积,免疫组化检测Brdu、肌钙蛋白T双染确定移植细胞的存活与分化,通过Ⅷ因子染色检测血管新生,通过RT-PCR检测HIF-1α基因的体内表达。结果:冠脉结扎法制作的大鼠心梗模型,其有效使用率为78.4%（80/102）。移植治疗4周后,联合组心梗面积小于细胞组与基因组的心梗面积（P＜0.05）;Buxco检测心功能显示LVSP、+dp/dtmax明显高于其他各组,LVEDP、-dp/dtmax明显低于其他各组;Ⅷ因子染色示联合组动物心梗区毛细血管密度高于细胞组和对照组（P＜0.05）,较基因组也有一定程度增加（P=0.054）;Brdu、肌钙蛋白T双染示各治疗组心梗区心肌细胞数量不同程度多于对照组,部分为双染阳性细胞;RT-PCR显示联合组HIF-1α的体内表达高于其他各组。结论:1.成功构建了HIF-1α-pcDNA3.1真核表达载体。2.HIF-1α-pcDNA3.1转染大鼠MSCs后能有效增加HIF-1α表达。3.HIF-1α转染MSCs移植可显著改善缺血心脏功能、促进血管发生、增加心梗区心肌细胞数量,其综合疗效优于单独基因治疗或细胞治疗。