共轭亚油酸—精氨酸耦合物抗膀胱癌活性的研究

论文摘要

研究表明,共轭亚油酸（CLA）可以诱导肿瘤细胞如乳腺癌、膀胱癌,肺癌、结肠癌等细胞的凋亡。但是,共轭亚油酸因水溶性低和在空气中易氧化,而限制了其功效的发挥。精氨酸（Arg）是一种水溶性氨基酸,本文利用精氨酸可以与共轭亚油酸形成酰胺键的化学性质,合成精氨酸-共轭亚油酸耦合物（ACLA）,观察了ACLA对膀胱癌T24细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行了初步探讨。采用化学方法合成ACLA,通过傅里叶红外光谱分析发现,在1552.13和1640.79cm-1处出现吸收峰,表征共轭亚油酸的羧基和精氨酸的氨基形成的酰胺键；同时应用高效液相色谱分析ACLA纯度为91.26%。应用MTT法检测ACLA、CLA、Arg对T24细胞活性的影响。结果显示：在50-200μM浓度范围处理膀胱癌T24细胞24-72小时,ACLA能显著降低T24细胞活性,其作用呈明显剂量和时间依赖性,且作用与CLA相比显著增强；Arg对T24细胞的活性没有明显影响。利用Hoechst33342对细胞进行染色,荧光显微镜观察细胞形态学变化,发现ACLA能明显诱导T24细胞凋亡,其浓度为200μmol/L,处理细胞时间为48h时,细胞凋亡明显,细胞核体积明显变小,皱缩,荧光染色增强。采用流式细胞术分析发现ACLA能诱导T24细胞凋亡,200μmol/LACLA、CLA诱导细胞凋亡率分别为92.03%和25.55%。精氨酸对T24细胞凋亡没有明显影响。应用蛋白免疫印迹法分析ACLA处理膀胱癌T24细胞后磷酸化Akt、Bcl-2、Bax、 caspase-3、PPARy蛋白表达的变化。发现ACLA能够抑制Akt的磷酸化,上调Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,同时活化型Caspase-3和PPARr表达增强。综上,ACLA耦合物能够诱导膀胱癌T24细胞凋亡,且其作用与CLA相比明显增强。ACLA诱导膀胱癌T24细胞凋亡的机制可能与p-Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3表达变化及上调PPARr蛋白有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 共轭亚油酸的结构和特点
• 1.2 共轭亚油酸的主要来源
• 1.2.1 天然来源
• 1.2.1.1 对亚油酸的瘤胃生物氢化作用
• 1.2.1.2 内源合成
• 1.2.2 人工合成
• 1.2.2.1 化学合成
• 1.2.2.2 微生物合成
• 1.3 CLA检测方法
• 1.3.1 紫外检测法（UV）
• 1.3.2 红外检测法（IR）
• 1.3.3 气相色谱法（GC）
• +-HPLC）'>1.3.4 高效液相色谱法（Ag⁺-HPLC）
• 1.3.5 气-质联用（GC-MS）
• 1.3.6 核磁光谱法
• 1.4 共轭亚油酸的生理功能
• 1.4.1 抗癌功能
• 1.4.2 抗氧化作用
• 1.4.3 降低血液和肝脏中的胆固醇
• 1.4.4 生长促进因子
• 1.4.5 对免疫系统的影响
• 1.4.6 减脂功能
• 1.4.7 其他功能
• 1.5 精氨酸的特点及生理功能
• 1.6 细胞凋亡
• 1.6.1 细胞凋亡的检测
• 1.6.1.1 显微镜和电镜分析
• 1.6.1.2 染色分析
• 1.6.1.3 流式细胞仪检测法
• 1.6.1.4 酶联免疫法
• 1.6.2 细胞凋亡基因
• 1.6.2.1 Bcl-2基因家族
• 1.6.2.2 p53基因
• 1.6.2.3 Caspase基因
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.2 试剂配制
• 2SO₄'>2.2.1 4M H₂SO₄
• 2.2.2 3M HCl
• 2.2.3 尿素甲醇饱和溶液
• 2.2.4 1%的硫酸-甲醇溶液
• 2.2.5 磷酸盐缓冲溶液（PBS）
• 2.2.5.1 10×PBS
• 2.2.5.2 1×PBS
• 2.2.6 RPMI 1640培养基
• 2.2.7 胰蛋白酶
• 3溶液'>2.2.8 7.4%NaHCO₃溶液
• 2.2.9 MTT 溶液
• 2.2.10 Hoeehst33342溶液
• 2.2.11 SDS-PAGE凝胶电泳
• 2.2.11.1 30%聚丙烯酰胺凝胶
• 2.2.11.2 20%十二烷基磺酸钠（SDS）
• 2.2.11.3 浓缩胶缓冲液
• 2.2.11.4 分离胶缓冲液
• 2.2.11.5 10×电泳缓冲液
• 2.2.11.6 10%过硫酸胺（APS）
• 2.2.12 蛋白免疫印记（Western blot）
• 2.2.12.1 10×running buffer
• 2.2.12.2 10×transfer buffer
• 2.2.12.3 转移平衡液
• 2.2.12.4 PBST 缓冲液
• 2.2.12.5 封闭剂（5%脱脂奶粉）
• 2.2.12.6 显影液
• 2.2.12.7 定影液
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 共轭亚油酸的纯化
• 2.3.1.1 皂化水解
• 2.3.1.2 纯化—尿素包合法
• 2.3.1.3 共轭亚油酸的甲酯化
• 2.3.1.4 共轭亚油的高效气相色谱分析
• 2.3.2 ACLA的制备
• 2.3.3 ACLA的鉴定
• 2.3.3.1 傅里叶红外光谱检测
• 2.3.3.2 高效液相色谱检测
• 2.3.4 T24细胞常规培养
• 2.3.4.1 细胞复苏
• 2.3.4.2 细胞传代
• 2.3.4.3 细胞冻存
• 2.3.5 倒置显微镜观察细胞形态学变化
• 2.3.6 MTT比色法检测细胞活力
• 2.3.7 流式细胞仪检测细胞凋亡（Annexin V/PI双染法）
• 2.3.8 Hoechst 33342染色
• 2.3.9 Western blotting蛋白印迹
• 2.3.9.1 细胞总蛋白提取
• 2.3.9.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.3.9.3 转膜
• 2.3.9.4 封闭
• 2.3.9.5 一抗孵育
• 2.3.9.6 洗膜
• 2.3.9.7 二抗孵育
• 2.3.9.8 洗膜
• 2.3.9.9 ECL显影
• 2.3.10 统计分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 共轭亚油酸纯化实验结果
• 3.1.1 尿素-甲醇添加量对CLA纯化率的影响
• 3.1.2 包合温度对CLA纯化率的影响
• 3.1.3 包合时间对CLA纯化率的影响
• 3.2 ACLA 表征
• 3.2.1 ACLA傅里叶红外光谱分析
• 3.2.2 ACLA高效液相色谱分析
• 3.3 MTT法检测ACLA对T24细胞活力的影响
• 3.4 流式细胞仪检测ACLA对T24细胞凋亡诱导作用
• 3.5 荧光显微镜检测ACLA对T24细胞凋亡诱导作用
• 3.6 ACLA诱导T24细胞凋亡机制
• 3.6.1 ACLA下调T24细胞中p-Akt蛋白表达
• 3.6.2 ACLA对T24细胞中Bcl-2家族蛋白的影响
• 3.6.3 ACLA对T24细胞中Caspase-3蛋白表达的影响
• 3.6.4 ACLA对T24细胞中PPARγ蛋白表达的影响
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 硕士期间研究成果