论文摘要
维生素C和维生素E是两种在维持水产动物健康养殖中应用较广的免疫增强剂,裂壶藻是一种富含不饱和脂肪酸的海洋真菌,本文通过结合免疫应答信号通路的相关基因的研究,探索两种维生素在机体中的免疫途径,初步研究裂壶藻与维生素E的免疫互作效应,为其免疫机制研究提供新的思路。本文以中国对虾为研究对象,在不同水平上研究了维生素C、维生素E和裂壶藻对中国对虾非特异免疫因子及TLR、NF-κB表达水平的影响。研究分为两部分:第一部分是以中国对虾为实验动物,对其投喂分别添加不同Vc含量（0%、0.5%、1%、2%）的饲料,在试验的第1、3、6、9、12和15天进行取样,以存活率、诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LZM）为免疫指标,探讨了不同浓度的Vc对中国对虾存活率及非特异性免疫效应的影响;并应用实时定量PCR方法研究了不同浓度的Vc对中国对虾TLR、NF-κB基因表达的影响。结果表明,（1）与对照组相比,Vc添加组增强了中国对虾的存活率,Vc1%添加组存活率达90.28%,显著高于其他组（P<0.05）。Vc的不同处理组在一定程度上提高了中国对虾iNOS、CAT、及LZM活性且1%含量Vc组对酶活性的增强影响较大。Vc对中国对虾T-SOD活性的提高具有一定的作用,2%浓度组对肝胰腺、鳃、肌肉T-SOD活性影响较大,1%浓度组对血清中T-SOD活性影响较大（2）实时定量PCR结果表明,Vc可以上调TLR在血液和鳃中TLR的表达水平。血液中1%浓度组对TLR的表达水平的上调作用最大,其次为0.5%浓度组。鳃中Ve对TLR的上调作用具有一定的浓度效应,即表达水平2%浓度组>1%浓度组>0.5%浓度组。在肝胰腺中Vc对0.5%、1%浓度组TLR的表达水平起到抑制作用,而对2%浓度组TLR则是先抑制后上调,在第十二天表达量达到最大值,为对照组的6.87倍。肌肉中Vc对2%浓度组TLR mRNA表达具有下调作用,对0.5%、1%浓度组TLR的表达呈现出先抑制后促进的状况。TLR、NF-κB在组织中的表达趋势并不一致,0.5%、2%浓度组在四种组织中均表现出下调作用。1%浓度组在血液、肌肉中对NF-κB的调节作用相同,与各自对照组相比均可以上调NF-κB的表达水平。而在鳃、肝胰腺中1%浓度Vc所起到的作用与血液和肌肉相反。第二部分是以中国对虾为实验动物,在基础饲料中添加不同含量的Ve和10裂壶藻,配制成五种试验饲料,即B组（10裂壶藻）、C组（200mg/kgVe）、D组（400mg/kgVe）、E组（600mg/kgVe）、F组（400mg/kgVe+10裂壶藻）,以基础饲料为A组（空白对照饲料）。进行为期1个月的饲养。在试验第1、15、30天进行体重、体长测量,检测Ve对中国对虾生长指标的影响。记录每日对虾死亡数,统计存活率。并以组织中的诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LZM）、谷胱甘肽酶（GSH）为免疫指标,探讨了不同浓度的Ve对中国对虾存活率及非特异性免疫效应的影响;应用实时定量PCR方法研究了不同浓度的Ve对中国对虾TLR、NF-κB基因表达的影响。结果表明,（1）Ve可以促进中国对虾体重、体长的增长。D组生长指标增长高于C、E组,但显著低于添加了裂壶藻的F组。存活率随着Ve添加浓度的增加而增大,E、F组显著高于其他各组。说明Ve对中国对虾的生长及存活率的提高有着显著的作用。添加裂壶藻也对生长和存活率的提高起到促进作用。通过对中国对虾非特异性酶活的检测,结果表明,与空白对照组相比,Ve抑制了MDA活性、肌肉中iNOS活性。对于其他非特异酶均表现出不同程度的促进作用。裂壶藻添加组B组与A组相比较非特异性酶活性无显著性差异,但与F组表现出显著性差异（P<0.05）,即F组酶活性显著高于B组。（2）应用实时定量PCR方法研究了不同浓度的Ve对中国对虾血液、肌肉及肝胰腺中TLR、NF-κB基因表达的影响。结果表明,Ve可以下调血液、肝胰腺和肌肉中的TLR表达水平,并具有一定的浓度效应;中浓度Ve对三个组织NF-κB基因的表达均起到抑制作用。添加10裂壶藻后, A、B、D、F组TLR表达水平在肝胰腺和肌肉中的趋势相同,表达水平为A>B>D>F;NF-κB基因表达在血液和肝胰腺中的趋势相同,表达水平为B>A>D>F,说明饲料中添加一定量的裂壶藻可以降低机体内TLR、NF-κB基因的表达水平,Ve和裂壶藻联合对免疫基因的调控能力更加显著。