论文摘要
目的胸水是肺部多种疾病的常见并发症，它也是验证疾病病因，判断其良恶性的重要媒介。大约20％的胸水是由恶性肿瘤引起，恶性肿瘤中的50％是原发性肺癌。约30％的肺癌患者最初的临床表现是胸水，而细胞病理学是诊断恶性胸水的标准方法。肺癌病灶浸破脏层胸膜，常引起胸腔积液，癌细胞可同时或随后脱入胸腔内，形成胸腔脱落癌细胞。一旦误诊，发展为胸膜转移多在短期内死亡。常规的细胞学检查主要是依靠癌细胞的形态特点进行诊断。由于癌细胞在积液中无组织及器官构架的束缚而自由漂浮和增生甚至经几代繁殖，失去了原来在组织中的形态特征，故单纯依靠形态学进行诊断敏感性较低，尤其是较早期异型性不太明显的癌细胞与反应性间皮细胞几乎无法区别，以至造成诊断结果中存在着相当数量的假阴性。建立一组科学、有效的诊断方法是提高肺癌诊断阳性率的有效途径，也是提高肺癌患者生存率与治愈率的关键。本课题以目前国内外死亡率较高的肺癌为主攻对象，以肺癌患者的胸水为检测基础，采用RT-PCR方法测定癌细胞中细胞角蛋白19（cytokeratin 19，CK19）转录水平；采用免疫细胞化学测定癌细胞的定位表达；取上清液，应用Westem blot测定CK19蛋白的定量表达；探讨诊断肺癌性胸水的新途径，评价这四种检测指标单一和联合应用对恶性胸水的临床应用价值。方法收集中国医科大学附属第一医院2005年9月至2006年4月门诊及住院患者108例，其中：原发性肺癌68例，肺良性疾病患者40例。1、免疫细胞化学染色（1）收集胸水中细胞沉渣制作石蜡包埋块。（2）切片，应用免疫细胞化学方法（streptavidin-peroxidase，S-P）染色。检测CK19及HBME-1的表达情况。2、逆转录多聚酶链式反应（Reverese transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）扩增及扩增产物的分析（1）收集胸水中细胞沉渣提取总RNA。（2）总RNA的反转录及CK19基因片段的扩增。（3）利用凝胶分析仪观察并分析结果。3、蛋白印记（Western blot）分析（1）测定胸水中蛋白浓度。（2）配置分离胶和浓缩胶，上样，电泳。（3）转印，封闭抗原后依次加入抗体反应。（4）显色并扫描记录并分析结果。结果1、免疫细胞化学检测CK19在肺癌患者胸水中的阳性率88.2％（60／68）明显高在良性胸水中的阳性率12.5％（5／40），，两组间CK19阳性表达率有显著性差异（x2=60.3，P＜0.01）。2、HBME-1在良性胸水中的阳性率95.0％（38／40）明显高于在肺癌患者胸水中的阳性率27.9％（19／68），两组间HBME-1阳性表达率有显著性差异（x2=42.0，P＜0.01）。3、RT-PCR检测肺癌组胸水中CK19mRNA阳性表达率为94.1％（64／68），肺良疾病组胸水中CK19mRNA阳性表达率为15％（6／40）。两组间CK19mRNA阳性表达率有显著性差异（x2=69.1，P＜0.01）；肺癌组胸水中CK19mRNA阳性表达率与病理分型无关（x2=1.71，P＞0.05）。4、Western blot检测肺癌组胸水中CK19蛋白水平明显高于非肺癌患者胸水中的平均水平，差异非常显著（F=12.5，P＜0.01）；胸水中CK19蛋白的表达量与病理分型无关（F=0.182，P＞0.05），将胸水中免疫蛋白印记水平做受试者工作曲线（AUC），将正常参考值定为蛋白印记＜22.4单位，可取得最佳敏感度86.8％（59／68）和特异度72.5％（29／40）。两组间Western blot阳性表达率有显著性差异（x2=38.8，P＜0.01）。5、四种检测指标单一及两两联合应用对肺癌性胸水诊断效能的比较，其中免疫细胞化学检测HBME-1与CK19mRNA联合应用有着最好的敏感度和特异度，分别为100％（68／68）、85.0％（34／40）。讨论CK19是上皮细胞中间丝的成分蛋白，表达于所有组织类型的肺癌，在鉴别良恶性胸水方面，是一种可靠的肿瘤标志物。理论上讲，只有上皮来源的细胞才能表达CK19，非上皮来源的细胞不表达，因此检测CK19表达与否有助于确定胸水内细胞的来源。良性胸水内只存在炎症细胞和间皮细胞，没有上皮来源细胞，如果出现CK19表达阳性的细胞多意味着上皮性肿瘤细胞转移所致。近年来研究发现，免疫细胞化学染色似乎在解决这一问题有较大的价值，能辅助肺癌患者胸水的细胞学诊断。CK19是上皮细胞的分子标记，HBME-1是间皮细胞的分子标记，本研究中两者联合应用构成一组正反互补单克隆抗体组，从正反两个方面筛查肺癌患者胸水中的癌细胞。结果显示，平行实验分析CK19和HBME-1的检测结果，确实能进一步提高诊断的效率，其敏感性和特异性可分别达88.2％（60／68）、85.0％（34／40）。采用RT-PCR技术检测胸水内的微转移癌细胞，以达到早期诊断目的。该方法具有较高的敏感性，可在106～107个细胞中检测到1个目标细胞。本研究结果提示用CK19mRNA检测肺癌患者胸水中癌细胞既可作为重要的诊断指标，又可作为检测肺癌胸膜转移的参考指标。CK19蛋白存在于癌细胞胞浆中，胸水中的癌细胞可分泌或因裂解而释放出CK19蛋白。本研究中，我们应用western blot方法检测肺癌或者胸水中CK19蛋白的表达情况。我们利用受试者工作特性曲线，选取敏感性与特异性均比较高的最佳临界点作为正常参考值，计算其对肺癌诊断的敏感度、特异度和准确度。本研究中，应用免疫细胞化学检测CK19及HBME-1，RT-PCR、Western blot检测CK19可有效的提高肺癌胸水诊断的敏感度，单独应用敏感度最高的为CK19mRNA达94.1％，特异度最高的为免疫细胞化学检测HBME-1达95.0％；四种检测指标两两联合应用时，免疫细胞化学检测HBME-1与CK19mRNA联合应用可获得最佳敏感度和特异度分别为100％（68／68）、85.0％（34／40），这两种检测指标的联合应用在保证诊断特异度（85.0％）的同时，充分的提高了诊断的敏感度（100％），对诊断癌性胸水有重要的临床价值，可作为研究早期癌细胞播散的一种重要方法，具有广泛的应用前景。结论1、应用免疫细胞化学检测CK19及HBME-1，RT-PCR、Western blot检测CK19可有效的提高肺癌胸水诊断的敏感度。2、免疫细胞化学检测HBME-1与CK19mRNA联合应用有着最好的敏感度和特异度，分别为100％（68／68）、85.0％（34／40），对癌性胸水的诊断有重要的临床应用价值。
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标签：肺肿瘤论文; 胸水论文; 肿瘤标志物论文; 逆转录聚合酶链反应论文; 细胞角蛋白论文;