ShRNA沉默基因DNMT1和DNMT3b对膀胱癌T24细胞生物学行为影响的研究

论文摘要

第一部分携带DNMT1-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT1基因表达抑制的研究目的构建携带针对基因DNA甲基转移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）mRNA的shRNA真核表达载体，并检测重组质粒对DNMT1的沉默效应。方法设计一条针对靶基因DNMT1 mRNA的shRNA序列和一条阴性对照序列，应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中，构建重组质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA和阴性对照质粒（HK）。将重组质粒转化到大肠杆菌E．coli DH5α中，经筛选后对提取质粒进行酶切鉴定和测序分析。将构建的重组质粒转染到T24细胞中，用RT-PCR和Western blot检测其在24、48和72h mRNA和蛋白的表达变化。结果重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确；DNMT1 mRNA在24、48和72 h的抑制率分别为28．44％、52．48％和70．91％；其蛋自在24、48和72 h的抑制率分别为24．27％、57．79％和69．74％。结论成功构建了pGensil-1-DNMT1-shRNA真核表达载体并能有效的沉默T24细胞中DNMT1 mRNA和蛋白的表达。第二部分携带DNMT3b-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT3b基因表达抑制的研究目的构建携带针对基因DNA甲基转移酶3b（DNA methyltransferase 3b，DNMT3b）mRNA的shRNA真核表达载体，并从构建成功的重组质粒中筛选出沉默效应最强的干扰序列。方法以基因DNMT3b mRNA为靶序列设计3条shRNA序列，应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体pGensil-1中，构建重组质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA1、pGensil-1-DNMT3b-shRNA2、pGensil-1-DNMT3b-shRNA3；经酶切鉴定和测序分析后，将重组质粒分别转染T24细胞中，应用RT-PCR和Western-blot检测各组质粒对DNMT3b mRNA和蛋白的表达抑制情况，并筛选最有效的干扰序列。结果各重组质粒经酶切鉴定和测序分析显示插入完全正确。RT-PCR结果经图象分析，shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b mRNA的抑制率分别为20．44％、79．91％和54．48％；Western blot结果经图像分析，shRNA1、shRNA2和shRNA3对DNMT3b蛋白的抑制率分别为17．27％、77．74％和56．79％。结论成功构建了质粒pGensil-1-DNMT3b-shRNA（1、2、3），并筛选出pGensil-1-DNMT3b-shRNA2为沉默效应最强的质粒。第三部分携带DNMT1-shRNA和DNMT3b-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT1和DNMT3b基因表达抑制的研究目的构建携带针对基因DNMT1 mRNA和DNMT3b mRNA的shRNA真核表达载体，并检测重组质粒对DNMT1和DNMT3b的沉默效应。方法用HindⅢ+EcoRⅠ对已成功构建的质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA1和pGensil-1．1-DNMT3b-shRNA进行双酶切，回收质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA1的小片段（含DNMT1-shRNA）和质粒pGensil-1．1-DNMT3b-shRNA的大片段（含DNMT3b-shRNA），构建质粒pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b；对构建质粒进行酶切鉴定和测序分析；用RT-PCR和Western blot检测其对DNMT1和DNMT3b mRNA和蛋白的抑制效率。结果重组质粒经MluI+EcoRI酶切鉴定和测序分析，结果设计序列一致；DNMT1mRNA在24、48和72 h的抑制率分别为28．79％、57．88％和80．24％；DNMT3b mRNA在24、48和72 h的抑制率分别为23．88％、52．82％和81．87％；DNMT1蛋白在24、48和72 h的抑制率分别为31．73％、58．27％和82．09％；DNMT3b蛋白在24、48和72h的抑制率分别为35．83％、59．87％和65．84％。结论成功构建了携带DNMT1-shRNA和DNMT3b-shRNA两条shRNA真核表达载体，并能有效沉默DNMT1和DNMT3b的表达，为下一步实验奠定了基础。第四部分shRNA沉默基因DNMT1和DNMT3b对膀胱癌T24细胞生物学行为影响的体外研究目的观察shRNA沉默DNMT1、DNMT3b以及联合沉默DNMT1和DNMT3b的表达对膀胱癌T24细胞增值和凋亡的影响，初步探讨DNMT1和DNMT3b在抑癌基因启动子区域CpG岛甲基化和膀胱肿瘤形成过程中的作用。方法实验分为空白对照组、pGensil-1-DNMT1-shRNA1组、pGensil-1．1-DNMT3b-shRNA组和pGensil-1-1-shRNA1-shRNA3b组；常规培养膀胱癌T24细胞，用脂质体lipofectamine 2000TM将各重组质粒转染进入膀胱癌T24细胞，用RT-PCR、Western blot检测各重组质粒对T24细胞中DNMT1和DNMT3b的沉默效率；用MTT和Annexin-VFITC／PI双染法流式细胞仪检测检测各重组质粒对T24细胞增值和凋亡的影响。结果各重组质粒成功转染进入膀胱癌T24细胞；转染72 h后，各组重组质粒能有效抑制相应基因的mRNA和蛋白的表达；pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b组在24、48和72 h的细胞生长抑制率分别为（12．45±1．98）％、（21．76±3．54）％和（37．07±4．23）％，较其他各组抑制明显，并和其它各组之间在三个时间点上均有显著性差异（P＜0．05）；pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b组在24、48和72 h的细胞凋亡率分别为（10．36±1．98）％，（20．23±3．62）％和（32．96±4．82）％，和其他各组在三个时间点上均有统计学差异（P＜0．05）。结论联合沉默基因DNMT1和DNMT3b的表达比单独沉默能更显著的抑制细胞增值和促进细胞凋亡，揭示了它们在抑癌基因启动子区域CpGd的超甲基化和膀胱肿瘤形成过程中存在协同作用。第五部分shRNA沉默基因DNMT1和DNMT3b对膀胱癌T24细胞生物学行为影响的体内研究目的观察沉默基因DNMT1、DNMT3b及联合沉默DNMT1和DNMT3b对裸鼠荷瘤生长的影响，初步探讨DNMT1和DNMT3b在膀胱肿瘤形成过程中的作用及相互关系。方法建立裸鼠膀胱肿瘤模型，成瘤后随机分成4组；一组为空白对照，另外三组瘤内分别注射含有重组质粒pGensil-1-DNMT1-shRNA1、pGensil-1．1-DNMT3b-shRNA和pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b的转染试剂，连续四次，每次间隔5天，此期间观察瘤体体积变化、绘制肿瘤生长曲线；处死裸鼠取出标本并制作石蜡切片，用免疫组化方法检测增值细胞核抗原（PCNA）在T24细胞中的表达；用TUNEL法检测T24细胞凋亡情况。结果成功构建了裸鼠荷瘤模型，空白对照组肿瘤体积随着时间的延长继续增大，注射转染试剂后pGensil-1．1-DNMT3b-shRNA组瘤体增长略有减缓，pGensil-1-DNMT1-shRNA1组生长出现平台，pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b组瘤体则明显变小甚至消失；PCNA检测中，pGensil-1-DNMT1-shRNA1组、pGensil-1．1-DNMT3b-shRNA组和pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b组阳性表达分别为50％、83．36％和22．73％；pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b组对肿瘤细胞增值能力的抑制明显高于其它各组；在凋亡检测中，pGensil-1-DNMT1-shRNA1组、pGensil-1．1-DNMT3b-shRNA组和pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b组阳性表达分别为59．09％、22．72％和81．09％pGensil-1．1-shRNA1-shRNA3b组对肿瘤细胞的凋亡作用明显高于其它各组。结论DNMT1对膀胱肿瘤生物学行为的影响起主要作用，但没有DNMT3b起辅助作用，其作用明显降低，实验结果揭示了DNMT1和DNMT3b在CpG岛甲基化过程中存在协同作用，并共同促进了膀胱肿瘤的形成。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 携带DNMT1-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT1基因表达抑制的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 携带DNMT3b-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT3b基因表达抑制的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 携带DNMT1-shRNA和DNMT3b-shRNA真核表达载体的构建及其对膀胱癌T24细胞DNMT1和DNMT3b基因表达抑制的研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 shRNA沉默基因DNMT1和DNMT3b对膀胱癌T24细胞生物学行为影响的体外研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第五部分 shRNA沉默基因DNMT1和DNMT3b对膀胱癌T24细胞生物学行为影响的体内研究
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 附录1 在校期间已发表和待发表的文章
• 附录2 中英文缩写词对照
• 致谢