导读:本文包含了测序载体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:绞股蓝,转录组测序,叁萜合成通路,定量PCR
测序载体论文文献综述
陈奇聪[1]（2018）在《绞股蓝转录组测序挖掘叁萜合成基因与鲨烯合酶正选择位点突变表达载体构建》一文中研究指出第一部分绞股蓝转录组测序挖掘叁萜合成通路及相关酶基因目的:通过对绞股蓝(Gynostemma pentaphyllum(Thunb.)Makino,G.pentaphyllum)的根、茎和叶叁个部位分别进行转录组测序分析,挖掘绞股蓝叁萜合成通路及相关酶基因。使用q PCR技术检验绞股蓝叁萜合成通路上呈现部位差异表达的法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase,FPS)、鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)和鲨烯环氧化酶(Squalene epoxidase,SE)基因在转录后水平的表达,验证它们在转录组测序分析中的表达规律。同时,使用紫外分光光度法测量叁萜皂苷在根、茎和叶叁个部位的含量差异,进一步验证FPS、SS和SE在根、茎和叶的表达差异。最后总结绞股蓝FPS、SS和SE表达的部位差异性规律与叁萜皂苷含量差异分布规律,为进一步研究绞股蓝叁萜合成相关基因表达调控机制做铺垫。方法:分别提取绞股蓝根、茎和叶叁个部位的RNA并进行转录组测序反应,结合KEGG通路数据库查找注释文件当中的绞股蓝叁萜合成关键酶基因FPS、SS和SE,寻找叁个基因的序列信息和标准化的RPKM表达值。按照|Fold Change|>2的标准查找差异化基因,总结FPS、SS和SE在根、茎和叶当中的分布差异规律。PCR克隆出FPS、SS和SE的全长基因片段,稀释成一系列浓度溶液为定量PCR的标准对照品。以绞股蓝根、茎和叶c DNA为定量PCR实验组的模板,探索FPS、SS和SE在根、茎和叶当中的表达规律。分别提取绞股蓝根、茎和叶中皂苷,使用D101树脂纯化后作为供试品,同时以人参二醇作为对照品,进行显色反应,使用可见光-紫外分光光度仪测量对照品组和供试品组的吸光度值,通过标准曲线法计算绞股蓝根、茎和叶叁部位中叁萜皂苷的含量,得到绞股蓝根、茎和叶中的叁萜皂苷分布差异。结果:绞股蓝转录组测序分析数据显示叁萜合成通路中,FPS、SS和SE叁个酶基因相对表达量RPKM的部位差异趋势与q PCR定量部位表达差异趋势相一致,即叶>茎>根(叶子表达量为最高)。采用紫外-可见分光光度法测量叁萜皂苷,结果表明叶的叁萜皂苷含量依次高于茎和根。转录组测序分析、定量表达q PCR实验和叁萜皂苷含量测定实验结果存在一致性。结论:转录组测序分析得到的FPS、SS和SE叁个酶基因根>茎>叶的差异表达规律在定量表达q PCR实验得到重复,叁萜皂苷含量测定实验进一步确认了该规律。绞股蓝FPS、SS和SE叁个酶基因的部位差异表达及叁萜皂苷的差异性分布将对后续绞股蓝叁萜合成通路相关基因的表达与调控机制研究奠定了基础,为靶向提高绞股蓝叁萜皂苷含量提供理论依据。第二部分绞股蓝鲨烯合酶正选择位点突变表达载体构建目的:结合正选择位点和PCR碱基突变技术,对绞股蓝鲨烯合酶SS进行正选择位点突变,构建野生型和正选择位点突变型的绞股蓝SS原核表达载体和真核表达载体。为后续的SS蛋白正选择位点突变与酶功能关联研究做铺垫,为理解SS结构与功能关系奠定基础。方法:根据转录组测序分析得到的SS序列设计SS全长扩增引物,PCR扩增出绞股蓝SS序列连接克隆载体并测序,获取绞股蓝SS野生型基因序列。设计合适的目的基因扩增引物,对扩增后目的片段和载体双酶切后再连接,构建真核表达载体pc DNA3.1(+)-SS。使用直接连接法构建原核表达p EASY-E1-SS。使用PCR突变技术分别对pc DNA3.1(+)-SS载体与p EASY-E1-SS载体上SS片段的正选择位点S109、S196、T390和S407进行突变反应,将丝氨酸S或苏氨酸T突变成脯氨酸P,获得野生型和突变型的SS原核与真核表达载体。结果:绞股蓝SS原核表达载体p EASY-E1-SS和真核表达载体pc DNA3.1(+)-SS构建成功,SS正选择位点突变成功,获得了突变前后的绞股蓝SS原核载体载体与真核表达载体结论:绞股蓝叁萜合成通路SS基因的克隆与正选择位点突变的异源表达载体构建,是下一步研究绞股蓝SS正选择位点与酶活性关联的基础,为研究绞股蓝SS一级结构与功能的关系提供了研究前提。(本文来源于《广西医科大学》期刊2018-05-01）
徐在超[2]（2018）在《基于高通量测序的功能微生物分析及其在对虾白斑综合症病毒载体疫苗构建中的应用》一文中研究指出微生物作为自然生态系统中的重要组成部分,在动物体,植物体、及其他自然环境中普遍存在,其对于维持自然环境的生态平衡和宿主的生理功能具有重要意义。因此,关于环境微生物多样性及其功能的研究已经成为微生物学的研究热点。由于常规培养技术的限制,目前在自然生态系统的各个环境中可用于分离培养的微生物不足1%,因此不依赖于分离培养的分子生物学方法在环境微生物学研究中得到了广泛的应用。然而,目前此类方法的研究重点大多局限于环境微生物类群多样性的分析,而对与环境或宿主功能直接相关的特定功能菌群的挖掘与分析还相对较少。因此,为了更好地探究高通量测序技术在功能微生物挖掘分析方面的应用效果,本文首先通过采用高通量测序技术对动物肠道益生菌群中细菌16S rRNA基因V3-V4高变区和冬虫夏草中真菌rRNA基因ITS2区进行测序分析;然后,结合对对虾肠道细菌菌群的分析结果及对虾白斑综合症病毒的研究现状,对对虾肠道细菌菌群进行了分离,同时筛选合适的载体启动子,以从对虾肠道内分离到的优势菌群肠杆菌作为载体菌株进行对虾白斑综合症病毒细菌载体疫苗的构建。主要研究结果如下:(1)采用高通量测序技术对羊粪样品中的芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和双歧杆菌(Bifidobacterium)进行属水平测序分析,测序得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上将其归类得到1922~63172不等的OTUs,样品覆盖率分别为0.89、0.99和1.00,Bacillus(芽孢杆菌属)(37.90%)、Clostridium(梭菌属)(52.50%)和Bifidobacterium(双歧杆菌属)(99.32%)均被检测出来且为主要的优势菌群。(2)对冬虫夏草虫体和子座中的真菌类群进行高通量测序分析得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上将其归类得到75~187不等的OTUs,样品覆盖率均为1.00。在虫体和子座中存在大量的共有菌群和各自特有菌群,Ophiocordyceps(线孢虫草菌属)(61.51%、5.30%)和Mortierella(被孢霉属)(26.86%、5.91%)为主要优势共有菌群,此外Tolypocladium(弯颈霉属)、Paecilomyces(拟青霉属)和Metarhizium(绿僵菌属)等也被检测出来并大多为共有菌群。(3)根据上述高通量测序技术在不同样品中微生物类群的分析效果,结合对虾肠道细菌的高通量测序结果显示γ变形菌纲的Enterobacteriaceae(肠杆菌科)(85%)类细菌是对虾各个生长时期的肠道主要优势细菌,本实验对其肠道细菌进行了分离培养,结果表明分离到的肠道细菌有81%归属于肠杆菌科。(4)通过采用四种不同的铁调控型启动子(fur promoter)与噬菌体PhiX174裂解酶基因E(lysis E)进行基因重组与蛋白表达的结果显示,本次实验构建的细菌菌蜕疫苗及载体启动子的筛选未达到预期的结果,需要进一步筛选影响特定毒力蛋白表达的启动子。(5)结合对对虾肠道优势菌群的分析分离结果以及合适启动子的筛选结果,本实验选用组成型启动子J23100、丁香假单胞菌冰核蛋白N端基因序列inaK-N和对虾白斑综合症病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28基因序列进行重组构建表达载体pJIVP28,以从对虾肠道中分离到的优势肠杆菌为载体菌株构建WSSV载体疫苗,结果显示该重组表达载体构建成功,WSSVVP28 ELISA试剂盒也检测出重组蛋白表达并具有良好的活性,并且在宿主菌中也稳定表达。综上所述,本论文的结果表明:在动物肠道中存在大量的功能菌群,采用特异性测序分析方法有助于对其进行深度挖掘和开发;冬虫夏草的自然资源枯竭,人工种植难度较大,以往研究中仅用一种菌导致虫草子实体培养失败,通过对比蛹虫草中Cordyceps(虫草菌属)(99%)测序结果可以推断虫草子实体的形成很可能由两种菌共同形成的,这对于虫草菌的分离培养及人工种植具有重要意义;对虾白斑综合症病毒(WSSV)是一种肠道感染病毒,通过分析对虾不同生长时期的肠道菌群变化,对其优势菌群进行分离培养,并以此作为载体菌株构建相关载体疫苗对对虾类水产动物养殖业的发展具有重要意义。(本文来源于《广东药科大学》期刊2018-03-28）
张广杰,崔悦悦,邱庆庆,夏琴,李龙[3]（2018）在《广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建》一文中研究指出【目的】克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础。【方法】利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以p EGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。【结果】克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与Gen Bank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸。广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%。构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白。【结论】广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究。(本文来源于《南方农业学报》期刊2018年02期）
刘骥,潘洁,田万帆,唐俊妮,赵燕英[4]（2016）在《新型肠毒素蛋白SElK编码基因的克隆测序、生物信息学分析和表达载体构建》一文中研究指出采用微波加热法提取金黄色葡萄球菌基因组DNA,根据NCBI上登录的肠毒素基因sek设计引物,PCR克隆selk基因,对selk基因测序并进行生物信息学分析,在此基础上构建重组表达质粒p ET-32a(+)-selk.测序结果表明本研究克隆得到具有正确编码序列的新型肠毒素selk基因;Protparam分析表明在一级结构水平上该蛋白具有较高的热稳定性;亲疏水性分析表明SEl K蛋白是一个亲水性较高的蛋白质;同源建模表明SEl K蛋白的domain B结构域缺乏传统肠毒素所具有的胱氨酸环,但SEl K蛋白domain B中β-折迭片数量比传统肠毒素更高.这些结果为进一步研究SEl K蛋白的结构与功能奠定基础.(本文来源于《西南民族大学学报(自然科学版)》期刊2016年03期）
曾庆东[5]（2016）在《小麦抗条锈病基因Yr26载体材料BAC文库构建及转录组测序》一文中研究指出小麦(Triticum aestivum L.)是世界上第二大粮食作物,全球30%的人口以它为主粮,中国是世界上小麦产量最大的国家。然而小麦的生产一直受到逆境条件的威胁,小麦条锈病作为小麦上最重要的病害之一,在世界范围内广泛发生,一般年份造成10-70%的产量损失,大发生时甚至绝收。中国作为世界上最大的条锈病流行区,年均发病面积约400万公顷,历史上曾有四次全国大流行,每次都造成了100万吨以上的产量损失。种植抗病品种被认为是防治条锈病最为经济有效的手段,在我国小麦条锈菌的核心越夏区甘肃陇南,2001-2013年间,流行频率最高的两个小种一直都是CYR32和CYR33,因此,能同时对这两个小种都具有抗病性的Yr26基因就广泛应用于小麦育种。然而,病原菌通过毒性变异,不断逃避抗病基因的识别,进而引发新的流行。比如在2008年第一次检测到对Yr26抗病基因有毒性的V26条锈菌系之后,这一菌系的流行频率不断上升,截止到2012年,在陇南地区的标样检测中其流行频率达到了16.10%,仅排在CYR32和CYR33的流行频率之后,这叁个小种的流行频率总和高达70%。生产上携带有Yr26基因的抗源川麦42、内麦8号、内麦9号、内麦10号、内麦11号以及绵麦37等一系列品种现已变成了这一新菌系的哺育材料,使得小麦条锈病的全国范围的大流行潜势很高,因此一方面通过图位克隆获取Yr26基因的序列,并通过Yr26基因与无毒性小种CYR32的互作,揭示专化抗病基因的抗病机理,对抗病基因的合理利用及培育持久抗病材料奠定理论基础;另一方面明确哪些抗条锈病基因对目前主要的叁个流行小种还具有利用价值,以期通过抗病基因的合理布局和开展预见性抗条锈病育种达到利用寄主抗病性来防控条锈病的目的。为此,本研究首先构建了其载体材料92R137的BAC文库,为Yr26基因的图位克隆奠定基础;随后通过对Yr26近等基因系接种条锈菌CYR32后进行转录组测序,研究Yr26基因介导的抗病信号通路,并获取可用于开发标记的序列信息,为Yr26基因的精细定位和功能分析奠定基础;最后为了应对当前对Yr26基因有毒性的新小种的出现,本研究对92份携带有已知的基因及对照材料分别接种CYR32、CYR33和V26,并结合田间调查,明确在生产中哪些抗病基因就还具有利用价值;本研究取得了如下研究结果:1)为了Yr26基因的图位克隆,用限制性内切酶HindIII和BamHI构建了Yr26基因载体材料92R137基因组DNA的两个BAC文库。HindIII构建的文库包含390,144个单克隆,经过随机挑选的453个单克隆的插入片段检测,这些克隆的平均插入片段为129kb,覆盖小麦基因组3.01倍,其中空载率为1.4%。BamHI构建的文库一共挑取了375,552个克隆,其中随机挑取了573个克隆检测插入片段大小,平均插入片段112.6 kb,覆盖了基因组2.53倍,空载率为3.4%。这两个文库加起来一共包含了765,696个克隆,存储于1,994个384孔板中,对小麦的基因组覆盖率为5.54倍。从中随机846个克隆进行检测,发现叶绿体污染率为0.71%。使用5-D混池策略,将所有BAC文库混合为超级池。为了检测所构建文库的可用性,使用Yr26基因的连锁标记Xwe173筛选上述超级池的DNA,成功获取了6个阳性克隆。2)为探索Yr26基因与CYR32的互作机理,本研究利用高通量的二代测序技术,对接种了条锈菌CYR32的Yr26基因的近等基因系小麦叶片进行了6个时间点的转录组测序,获取了约29亿个reads和365G的clean data。与中国春的参考基因组比对后,在所有的112496个基因中,鉴定到了68985个表达基因。通过对接种后同一时间点下,NIL-R与NIL-S的差异表达基因分析,一共鉴定到了14449个显着差异表达的基因,重点分析了参与光合作用、激素代谢和防卫反应信号通路的差异基因的表达模式。发现参与光合作用的基因显着下调表达,不同的激素表达模式差异较大,而防卫反应基因呈现较强的上调表达趋势。这一研究工作提供了研究小麦与条锈病互作更加全面系统的视角,也为下一步的重点研究工作奠定了基础。3)由于对Yr26基因有毒性的新菌系的出现,原有的许多抗病品种变成哺育材料,为了充分利用品种抗病性来控制条锈病的流行,本研究利用当前流行频率最高的3个小种(CYR32、CYR33、V26(菌系编号平南17-5)),对92份携带已知抗条锈病基因的小麦材料分别进行苗期和成株期抗病性鉴定,结合多年的天水自然病圃的调查,以评估各已知Yr基因在中国抗病育种中的有效性,为抗条锈病育种提供理论基础及育种材料。分析结果表明,所有供试材料中,只有Yr5、Yr15和Yr61这3个基因对当前流行小种表现为全生育期抗病性;Yr32、YrTr1和YrTye这3个基因具有成株期抗病性;此外,Mega、Ibis、Hyak、Maris Huntsman、Hobbit、CarstensV、Express、Lee和Compair等9份含多个Yr基因组合的材料表现出良好的成株期抗条锈性,这些抗病基因均可应用于当前的抗病育种中。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2016-05-01）
戴鹏秀[6]（2016）在《须癣毛癣菌转录组测序分析及ZafA基因遗传转化用双元载体的构建》一文中研究指出须癣毛癣菌(Trichophyton Mentagrophytes)是常见的人畜共患皮肤癣菌病病原,可引起严重的皮肤感染,但目前常用的真菌性皮肤病的防治手段相对简单,对于该菌的研究仍大都停留在流行病学和药物疗效等方面,已不能满足临床医学的需求。在真菌等微生物的生长和繁殖中,锌是一种重要的微量营养元素,其常与多种功能蛋白结合以形成锌指蛋白来完成生物学功能。目前,多种真菌的锌吸收转运调控因子已经明确,如:烟曲霉的ZafA蛋白、酵母菌的Zap1蛋白等,此类蛋白作为锌响应活力因子可在转录水平上对多种锌转运蛋白的表达进行调控,从而控制真菌对锌离子的摄取,在真菌的生长和致病过程中扮演重要角色。但目前,须癣毛癣菌的锌响应活力因子的基因组成及功能还未确定,锌吸收转运调控网络尚不清楚,确定须癣毛癣菌中锌响应活力因子以及锌转运蛋白的基因组成对于须癣毛癣菌致病性的研究具有重要意义。研究发现多种真菌的锌响应活力因子的基因组成具有一定的相似性,初期试验,以烟曲霉锌响应活力因子的基因序列为基础设计引物,以须癣毛癣菌全基因组DNA、cDNA为模板进行PCR扩增,经过多次试验发现无法获得须癣毛癣菌锌响应活力因子的基因组成。因此,我们使用Illumina HiSeqTM 2000技术对正常状态下及锌缺乏情况下的须癣毛癣菌进行了转录组测序,并对测序数据进行了从头组装、基因功能注释以及基因的差异表达分析等,后续通过BLASTX序列相似性搜索以及对须癣毛癣菌转录组测序数据的分析确定出须癣毛癣菌锌响应活力因子的基因组成,初步推断出与锌吸收转运相关的其他基因;并使用重组克隆技术构建了针对ZafA基因的遗传转化用双元载体,为后续的基因功能验证奠定了基础。研究结果如下:1使用Illumina测序平台对须癣毛癣菌进行了RNA-seq,共获得10751个unigenes,89%以上的基因得到功能注释,对于须癣毛癣菌的基因功能研究以及基因组图谱的组装提供了宝贵的数据支持。2通过与烟曲霉ZafA基因、酿酒酵母Zap1基因进行序列同源性比对以及功能注释分析等,确定了须癣毛癣菌中与锌吸收转运相关的基因并高保真扩增出须癣毛癣菌ZafA基因。3将ZafA基因左右侧翼片段以及来自质粒pAN7-1的潮霉素B抗性基因(hph)同时插入到双元载体pDHt/SK中,构建ZafA基因转化用双元载体pDHt/ZafAⅠ、Ⅱ::hph,经PCR及酶切验证,双元载体构建成功。试验结果表明,本研究完成了须癣毛癣菌的转录组测序及功能注释;确定了须癣毛癣菌ZafA基因的组成,并成功地构建了转化用双元载体pDHt/ZafAⅠ、Ⅱ::hph,为之后的ZafA基因的毒力试验及功能验证奠定了基础。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2016-05-01）
赵汀,周宝良[7]（2014）在《Vector cleaner:一种新的去除测序目的基因载体序列的方法》一文中研究指出Sanger测序法测序目的基因常包含有目的基因和载体序列,为了快速去除测序目的基因载体序列,提出了一种新的目的基因载体序列去除方法并开发了程序Vector cleaner。首先利用该程序批量读取引物信息和目的基因测序序列;其次,程序在所读取的引物序列上建立引物半长的滑动窗口来产生种子,通过计数种子与测序序列的匹配次数,定位引物位置和删除引物两侧的载体序列;最后,程序通过比较上游引物序列和其反向互补序列分别与测序序列匹配种子数,判断和转换正义链。使用Vector cleaner对12条GhVIN1基因测序序列进行去载体测试,并与Seqclean和SeqMan软件相比较。结果表明:Vector cleaner能有效去除棉花GhVIN1基因测序载体序列,识别并翻译反义链序列。与Seqclean和SeqMan软件相比较,Vector cleaner正确率高,敏感性强。Vector cleaner、SeqMan和Seqclean所测试序列的总序列数正确率分别为100%、100%和91.6%,总碱基正确率分别为99.90%、99.00%和94.33%。与同类软件比较,Vector cleaner更适合实验人员批量去除测序目的基因载体序列,具有准确率高、敏感性强、自动翻译反义链的特点。(本文来源于《南京农业大学学报》期刊2014年04期）
张尚松,苏玉虹,巴彩凤[8]（2014）在《猪skMLCK基因全长cDNA测序及真核表达载体构建》一文中研究指出为获得猪骨骼肌肌球蛋白轻链激酶(skeletal muscle myosin light chain kinase,skMLCK)基因全长cDNA序列,构建猪skMLCK基因的真核表达载体,参考GenBank预测信息并利用Primer Premier 5.0和DNAMAN生物学软件,分2段进行RT-PCR扩增,进行猪skMLCK基因的cDNA全长克隆、测序、拼接、合成,构建猪skMLCK基因的真核表达载体。结果获得了猪skMLCK基因的全长cDNA序列,序列长度为1 851 bp。成功构建了猪skMLCK基因的真核表达载体,重组质粒为pEGFP-N1-skMLCK。猪skMLCK基因全长cDNA的测序和真核表达载体的构建为进一步研究猪skMLCK基因在肌纤维生长发育中的作用奠定基础,为通过基因水平来改善与评价猪肉质性状提出了一个新方向。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2014年03期）
赵磊[9]（2013）在《苹果茎沟病毒的全基因组测序及其侵染性克隆载体的构建》一文中研究指出苹果是全世界种植最广泛的重要水果之一。中国无论在苹果种植面积还是产量方面都是世界第一。陕西省是中国的苹果大省，种植面积约600000公顷，产量约占全世界的12%。然而，苹果病毒病的发生却严重影响着苹果的产量和质量。在中国，侵染苹果的主要病毒有苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus, ASGV）、苹果茎痘病毒（Applestem pitting virus, ASPV）和苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）。其中苹果茎沟病毒属于发形病毒属，在全世界范围内发生。本研究于2011-2012年，建立了一种快速、灵敏的检测苹果茎沟病毒的方法，并扩增得到了苹果茎沟病毒的全基因组序列（ASGV-SHX）,其全长为6495bp。基于其全基因组序列以及其外壳蛋白基因的序列以及其它已报道的苹果茎沟病毒序列构建了其系统进化树，分析了其遗传多样性。据我们所知，这是在中国首次报道苹果茎沟病毒的全基因组序列。研究发现，苹果茎沟病毒的基因组RNA包含两个开放阅读框：ORF（16.3kb）和ORF2(1kb)，分别编码241和36kDa的蛋白。ORF1编码一个多聚蛋白，ORF2编码运动蛋白和蛋白酶基因。苹果茎沟病毒中国分离物的全基因组核苷酸序列与GeneBank已报道的苹果茎沟病毒序列比对发现，ASGV-SHX与日本已报道的登录号为NC_0011749的序列同源率最高为86%。外壳蛋白基因与登录号为D16681和AB004063的序列同源率最高为93%。外壳蛋白基因是苹果茎沟病毒最保守的基因。外壳蛋白的系统进化分析发现，全世界的苹果茎沟病毒分为叁个组，每一个组都含有中国的分离物。其中第一组分离物的寄主全部是苹果，主要来自中国、日本、印度、巴西以及韩国。第二组分离物全部来自中国。第叁组大部分来自中国，还有美国。各分离物无明显的地理差异，而有一定的寄主差异。为了进一步了解该病毒，本研究构建了其侵染性克隆载体。然后利用农杆菌介导的方法侵染4周龄左右的昆诺藜。对昆诺藜叶片检测结果发现，接种叶片可以检测到该病毒，而接种叶上部的叶片则检测不到。这表明，所构建的侵染性克隆载体可以在昆诺藜内完成转录的过程，而不能表达蛋白。这可能是由于载体5’端没有帽子结构，导致转录的RNA易降解，不能翻译蛋白所致。下一步我们可以将ASGV的全基因组构建到T7启动子载体上，然后利用体外转录的方法，在5’端加上帽子类似物，然后转录昆诺藜，来验证其是否有活性。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2013-05-01）
徐双年,陈洁平[10]（2011）在《小鼠c-myb特异性shRNA慢病毒表达载体的构建和测序鉴定》一文中研究指出目的:利用RNA干扰技术,以小鼠c-myb基因为靶基因,设计c-myb基因特异性的小干扰RNA(smallinterfering RNA),构建其短发卡结构RNA(short hairpinRNA)重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。方法:参考GenBank数据库中小鼠c-myb序列(NM_010848),利用Invitrogen公司的BLOCK-iT?RNAi Designer在线软件设计RNAi干扰靶点,挑选3段长为19bp的特异性寡核苷酸为靶序列(分别为:GGACTGATAATGCTATCAA,起始位点793;CCATCCAGAGACACTATAA,起始位点1102;(本文来源于《第13届全国实验血液学会议论文摘要》期刊2011-11-24）
测序载体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
微生物作为自然生态系统中的重要组成部分,在动物体,植物体、及其他自然环境中普遍存在,其对于维持自然环境的生态平衡和宿主的生理功能具有重要意义。因此,关于环境微生物多样性及其功能的研究已经成为微生物学的研究热点。由于常规培养技术的限制,目前在自然生态系统的各个环境中可用于分离培养的微生物不足1%,因此不依赖于分离培养的分子生物学方法在环境微生物学研究中得到了广泛的应用。然而,目前此类方法的研究重点大多局限于环境微生物类群多样性的分析,而对与环境或宿主功能直接相关的特定功能菌群的挖掘与分析还相对较少。因此,为了更好地探究高通量测序技术在功能微生物挖掘分析方面的应用效果,本文首先通过采用高通量测序技术对动物肠道益生菌群中细菌16S rRNA基因V3-V4高变区和冬虫夏草中真菌rRNA基因ITS2区进行测序分析;然后,结合对对虾肠道细菌菌群的分析结果及对虾白斑综合症病毒的研究现状,对对虾肠道细菌菌群进行了分离,同时筛选合适的载体启动子,以从对虾肠道内分离到的优势菌群肠杆菌作为载体菌株进行对虾白斑综合症病毒细菌载体疫苗的构建。主要研究结果如下:(1)采用高通量测序技术对羊粪样品中的芽孢杆菌(Bacillus)、梭菌(Clostridium)和双歧杆菌(Bifidobacterium)进行属水平测序分析,测序得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上将其归类得到1922~63172不等的OTUs,样品覆盖率分别为0.89、0.99和1.00,Bacillus(芽孢杆菌属)(37.90%)、Clostridium(梭菌属)(52.50%)和Bifidobacterium(双歧杆菌属)(99.32%)均被检测出来且为主要的优势菌群。(2)对冬虫夏草虫体和子座中的真菌类群进行高通量测序分析得到了大量的目的菌群序列,在97%的相似水平上将其归类得到75~187不等的OTUs,样品覆盖率均为1.00。在虫体和子座中存在大量的共有菌群和各自特有菌群,Ophiocordyceps(线孢虫草菌属)(61.51%、5.30%)和Mortierella(被孢霉属)(26.86%、5.91%)为主要优势共有菌群,此外Tolypocladium(弯颈霉属)、Paecilomyces(拟青霉属)和Metarhizium(绿僵菌属)等也被检测出来并大多为共有菌群。(3)根据上述高通量测序技术在不同样品中微生物类群的分析效果,结合对虾肠道细菌的高通量测序结果显示γ变形菌纲的Enterobacteriaceae(肠杆菌科)(85%)类细菌是对虾各个生长时期的肠道主要优势细菌,本实验对其肠道细菌进行了分离培养,结果表明分离到的肠道细菌有81%归属于肠杆菌科。(4)通过采用四种不同的铁调控型启动子(fur promoter)与噬菌体PhiX174裂解酶基因E(lysis E)进行基因重组与蛋白表达的结果显示,本次实验构建的细菌菌蜕疫苗及载体启动子的筛选未达到预期的结果,需要进一步筛选影响特定毒力蛋白表达的启动子。(5)结合对对虾肠道优势菌群的分析分离结果以及合适启动子的筛选结果,本实验选用组成型启动子J23100、丁香假单胞菌冰核蛋白N端基因序列inaK-N和对虾白斑综合症病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28基因序列进行重组构建表达载体pJIVP28,以从对虾肠道中分离到的优势肠杆菌为载体菌株构建WSSV载体疫苗,结果显示该重组表达载体构建成功,WSSVVP28 ELISA试剂盒也检测出重组蛋白表达并具有良好的活性,并且在宿主菌中也稳定表达。综上所述,本论文的结果表明:在动物肠道中存在大量的功能菌群,采用特异性测序分析方法有助于对其进行深度挖掘和开发;冬虫夏草的自然资源枯竭,人工种植难度较大,以往研究中仅用一种菌导致虫草子实体培养失败,通过对比蛹虫草中Cordyceps(虫草菌属)(99%)测序结果可以推断虫草子实体的形成很可能由两种菌共同形成的,这对于虫草菌的分离培养及人工种植具有重要意义;对虾白斑综合症病毒(WSSV)是一种肠道感染病毒,通过分析对虾不同生长时期的肠道菌群变化,对其优势菌群进行分离培养,并以此作为载体菌株构建相关载体疫苗对对虾类水产动物养殖业的发展具有重要意义。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
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