结核杆菌和布鲁氏杆菌多价DNA疫苗的研究

论文摘要

结核病和布鲁氏病是严重危害人类健康和畜牧业发展的人畜共患传染病。疫苗是控制结核病和布鲁氏病的有效方法。目前,BCG是预防结核病的唯一疫苗,但其免疫效力不稳定,且对成年人无保护;S19疫苗是在牛布鲁氏病中使用的疫苗,但血清学反应强,且安全性受到质疑,有感染人的可能。因此,高效的新型疫苗对于控制结核病和布鲁氏病蔓延至关重要。本论文在阐述结核病和布鲁氏病疫苗研究的基础上,着重分析了DNA疫苗的作用机制、发展现状及其改进策略。用分子生物学的方法分别构建了编码结核杆菌三种抗原（Ag85B,MPT64和MPT83）和布鲁氏杆菌三种抗原（BCSP31,SOD,和L7/L12）的原核表达载体,诱导表达并纯化后得到抗原蛋白。构建此六种抗原的真核表达载体,进行体外瞬时表达实验,用GFP偶联和RT-PCR等方法确定蛋白表达的部位和表达量。大量提取制备真核质粒作为DNA疫苗,免疫小鼠三次后8周,用高剂量的结核杆菌或布鲁氏杆菌感染小鼠或大动物牛。本文从体液免疫水平、细胞因子水平、分泌细胞因子细胞的数量、T细胞激活比例、T细胞亚型的变化、杀伤性T细胞的定量、结合动物感染后脏器载菌量等多个指标,对各个组合的疫苗的优势及所诱导免疫反应的进行综合评价,以期对DNA疫苗效力及其佐剂触发免疫反应的机制进行诠释。实验结果表明,多价DNA疫苗能够诱导更强的TH1型免疫反应,扩大保护范围,保护效力显著高于单价DNA疫苗。通过对比联合疫苗与不同矿物质佐剂、基因佐剂共同免疫后所产生的保护效果,证实佐剂基因佐剂IL-2、IL-12、IL-15、和无机佐剂DDA在诱导TH1型细胞反应,增强杀伤性T细胞的功能方面发挥重要作用。尤其是用六种抗原联合DNA疫苗与IL-12共同免疫,产生了“一针治两病”的效果,保护效率显著高于目前使用的BCG和S19传统疫苗。IL-15佐剂显著提高了分泌IFN-γ的CD8+T细胞的数量,从体内、体外实验证实了CD8+T细胞在对抗布鲁氏杆菌过程中的重要作用。多肽佐剂KLKL5KLK提高了APC细胞对抗原的摄取、加工和递呈能力,延长了免疫保护期、增强CD4+T细胞作用和细胞杀伤水平,为临床应用提供了重要证据。用包裹剂PLGA达到DNA缓释和避免核酸酶对DNA降解的效果以减少免疫剂量,结果表明PLGA在提高抗原表达量,延长表达时间上有显著作用,在免疫攻毒试验中,免疫一次PLGA包裹的多价DNA疫苗产生了与免疫三次不加PLGA的多价DNA疫苗类似的保护效力。BCG疫苗加强策略在大动物牛中的实验表明,加强策略显著提高了免疫牛中CD4+T细胞的比例,诱导了高水平的IFN-γ,且一直持续到攻毒后22周。用结核杆菌强毒株感染小鼠,构建潜伏期感染的动物模型。感染后8周,用异烟肼和吡嗪酰胺治疗3个月。治疗期间,用编码三种结核杆菌抗原的基因联合治疗,使免疫应答朝TH1型方向进行,产生更多的TH1型的细胞因子如IFN-γ,使吞噬有结核杆菌的巨噬细胞从休眠状态转变为活化型,以杀死结核杆菌,提高治疗效率,降低载菌量,使治疗时间减少一半,克服由于长期使用药物产生耐药性等问题。对开发有实际意义的治疗用核酸疫苗具有重要的启示。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 关于结核病和布鲁氏病
• 1.1.1 结核病现状分析
• 1.1.2 结核杆菌的致病机制
• 1.1.3 布鲁氏病现状分析
• 1.1.4 布氏杆菌致病机制
• 1.2 结核杆菌和布鲁氏杆菌疫苗的研究
• 1.2.1 卡介苗的应用、局限和改进
• 1.2.2 新型结核杆菌减毒活菌疫苗
• 1.2.3 亚单位疫苗的策略
• 1.2.4 重组融合蛋白
• 1.2.5 初免-加强免疫策略
• 1.2.6 布氏杆菌疫苗
• 1.3 DNA 疫苗
• 1.3.1 DNA 疫苗的免疫机理
• 1.3.2 结核杆菌和布氏杆菌DNA 疫苗
• 1.3.3 提高DNA 疫苗效率的策略
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 主要实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌种、细胞系及试剂
• 2.2 分子水平操作
• 2.2.1 目的基因克隆
• 2.2.2 DNA 疫苗的制备
• 2.2.3 微球包裹剂型DNA 疫苗制备
• 2.2.4 重组抗原的表达、纯化与复性
• 2.2.5 定量PCR
• 2.2.6 Western blotting
• 2.3 细胞因子及化学因子分析
• 2.3.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 2.3.2 牛IFN?γ的测定
• 2.3.3 CBA（Cytokine Beads Array）
• 2.3.4 IFN?γ及GrB ELISPOT
• 2.3.5 NO 含量测定
• 2.4 细胞水平分析
• 2.4.1 细胞转染
• 2.4.2 细胞亚型分析
• 2.4.3 T 细胞亚群分选
• 2.4.4 体外细胞杀伤实验
• 2.4.5 牛PPD 测试与淋巴细胞增殖实验
• 2.5 动物实验
• 2.5.1 动物免疫及治疗方案
• 2.5.2 免疫组织化学
• 2.5.3 体内T 细胞封闭实验
• 2.5.4 攻毒实验和活菌计数
• 2.6 显著性统计
• 第三章 布氏杆菌三价DNA 疫苗的效用评价
• 3.1 引言
• 3.2 结果
• 3.2.1 对 C57BL/6 小鼠的保护力
• 3.2.2 体液免疫反应
• 3.2.3 细胞因子水平
• 3.2.4 分泌IFN-γ的细胞
• 3.2.5 目的抗原在体内的表达
• 3.2.6 淋巴细胞亚型的鉴定
• 3.2.7 以GrB 为标志的CD8+细胞杀伤反应
• 3.3 讨论
• 第四章 提高DNA 疫苗免疫效果的研究
• 4.1 IL-2 提高了DNA 疫苗的TH1 型反应
• 4.1.1 前言
• 4.1.2 结果
• 4.1.2.1 表达载体的构建及目的抗原鉴定
• 4.1.2.2 T 细胞亚型
• 4.1.2.3 细胞因子水平和保护效力
• 4.1.2.4 病理学分析
• 4.1.2.5 目的抗原表达谱
• 4.1.3 讨论
• 4.2 IL-15 增强了DNA 疫苗诱导的CTL 水平
• 4.2.1 前言
• 4.2.2 结果
• 4.2.2.1 TH1 型免疫反应
• 4.2.2.2 分泌IFN-γ的细胞
• 4.2.2.3 CTL 反应
• 4.2.2.4 体内封闭实验
• 4.2.3 讨论
• 4.3 IL-12 联合六价DNA 疫苗同时对抗结核和布氏杆菌
• 4.3.1 引言
• 4.3.2 结果
• 4.3.2.1 抗体水平
• 4.3.2.2 T 细胞亚型的比例
• 4.3.2.3 TH1 型细胞因子水平
• 4.3.2.4 CTL 反应
• 4.3.2.5 释放GrB 的细胞和穿孔素的测定
• 4.3.2.6 TLR 基因的表达和一氧化氮（NO）水平
• 4.3.2.7 脏器载菌量
• 4.3.3 讨论
• 4.4 佐剂DDA 有利于提高DNA 疫苗效力
• 4.4.1 前言
• 4.4.2 结果
• 4.4.2.1 抗原特异性抗体
• 4.4.2.2 IFN-γ和IL-4 分析
• 4.4.2.3 肺部病理变化
• 4.4.2.4 保护效果分析
• 4.4.3 讨论
• 4.5 多肽佐剂KLKL5KLK 与DNA 疫苗的联合作用效果研究
• 4.5.1 引言
• 4.5.2 结果
• 4.5.2.1 特异性抗体水平
• 4.5.2.2 获得性免疫水平
• 4.5.2.3 细胞因子的检测
• 4.5.2.4 体外细胞杀伤活性的检测
• 4.5.2.5 保护效果分析
• 4.5.3 讨论
• 4.6 包裹剂PLGA 减少了DNA 疫苗的用量
• 4.6.1 前言
• 4.6.2 结果
• 4.6.2.1 微球的大小与形态
• 4.6.2.2 目的抗原的体内表达
• 4.6.2.3 目的基因体内表达谱
• 4.6.2.4 高水平的IFN-γ
• 4.6.2.5 保护效果分析
• 4.6.3 讨论
• 4.7 DNA 初免—BCG 加强策略
• 4.7.1 引言
• 4.7.2 结果
• 4.7.2.1 IFN-γ水平
• 4.7.2.2 抗体水平
• 4.7.2.3 淋巴细胞增殖
• +T 细胞为主的T 细胞增殖'>4.7.2.4 CD4⁺T 细胞为主的T 细胞增殖
• 4.7.2.5 各组攻毒前PPD 测试
• 4.7.2.6 保护效果分析
• 4.7.2.7 剖检结果
• 4.7.3 讨论
• 第五章 DNA 疫苗联合化学药物提高结核病的治疗效果
• 5.1 引言
• 5.2 结果
• 5.2.1 治疗方案
• 5.2.2 抗原特异性TH1 型免疫反应
• 5.2.3 IFN-γELISPOT
• high 的T 细胞'>5.2.4 表达CD44^high 的T 细胞
• 5.2.5 预防结核病复燃
• 5.2.6 病理结果
• 5.2.7 IL-12 和NO 水平
• 5.3 讨论
• 第六章 总结与展望
• 7.1 总结
• 7.2 创新点
• 7.3 下一步的工作
• 发表文章
• SCI 收录（11 篇）
• EI 收录（2 篇）、核心期刊（2 篇）及会议论文（3 篇）
• 参考文献
• 致谢