疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶的基因克隆与表达

论文摘要

脂肪酶（lipase, EC 3.1.1.3）,全称三酰甘油酰基水解酶,广泛存在于生物体内。它能够催化油脂上甘油酯键的水解,也可催化酯交换、酯化、醇解和酸解等反应。微生物来源的脂肪酶由于作用多样、易于培养、产量丰富等特点而被广泛用于工业生产,其中热稳定脂肪酶的研究和开发更是具有重要的商业价值。疏棉状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）是一种分布广泛、生长上限温度较高的真菌。它能够产生热稳定的具有重要工业价值的脂肪酶,但是野生菌产酶存在培养温度高等较多不利因素,因而近年来主要研究方向集中于采用基因工程方法构建重组菌,进而表达获得脂肪酶。本研究中T.lanuginosus在添加橄榄油的诱导培养基上产生了脂肪酶。根据已报道的脂肪酶同源保守序列,以及GenBank已注册的T.lanuginosus脂肪酶序列（AF054513）设计特异引物,综合运用PCR、RT-PCR、Tail-PCR技术克隆到两个脂肪酶基因的全长DNA和cDNA序列,将两个基因分别命名为lgy和ln。其中lgy基因DNA序列长1071bp,有3内含子;cDNA序列长885bp,开放阅读框编码291个氨基酸,其中前17个氨基酸构成信号肽,序列提交GenBank,登录号分别为EU022703和EU370914。ln基因DNA序列长1209bp,含有3个内含子;全长cDNA序列为1095bp,包含一个编码291个氨基酸的开放阅读框,前17个氨基酸构成信号肽。序列在Genbank中注册,登录号为EU004197和EU004196。比对分析由核苷酸序列推导的相应氨基酸序列,发现两个脂肪酶均具有G-H-S-L-G,即霉菌脂肪酶保守序列。二者氨基酸同源性为78.69%。将基因lgy和ln分别与酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接,构建酵母重组表达载体pPIC9K/lgy和pPIC9K/ln,并测序保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/lgy、pPIC9K/ln和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacⅠ（位于5’AOX1区内）线性化后,采用电击法转化Pichia pastoris GS115酵母感受态细胞,于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子,进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的脂肪酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株GS-LGY-3和GS-LN-6,甲醇诱导均为6d酶活性达到最高,分别达7.2 U/mL和6.1U/mL。检测目的蛋白的表达量及遗传稳定性,并测定表达脂肪酶的酶学性质。酵母工程菌株GS-LGY-3和GS-LN-6在YPD平板上划线,连续传代10次后,PCR检测呈阳性,重组脂肪酶的表达量基本保持稳定。表达脂肪酶LGY的最适反应温度和pH分别为60℃和8.0,该酶在60℃以下稳定,70℃的半衰期为15min,在pH值为6.09.0之间表达脂肪酶保持稳定的酶活性;表达脂肪酶LN的最适反应温度和pH分别为60℃和9.0,该酶在60℃下稳定,80℃半衰期为30min,90℃条件下半衰期是18min,比LGY热稳定性更好,在pH值为9.011.0之间表达酶活性较稳定。两种重组酶在金属离子存在的环境中表现相似,Ca2+对酶有明显的激活作用,Li+、Mg2+、Na+、Ba2+对酶影响不大,Fe2+、Zn2+、K+、Ag+对酶有显著的抑制作用。T.lanuginosus脂肪酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白,而且表达产物同样具有原始菌株T.lanuginosus脂肪酶的优良特性（在60℃下1h内稳定,最适反应温度较高达到60℃）,这预示了表达脂肪酶在生物学领域和化工工业的广阔应用前景。因此,期望能对该基因进行分子改造、表达条件的进一步优化,以获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1 脂肪酶的分类
• 2 脂肪酶产生菌及其筛选
• 2.1 脂肪酶产生菌
• 2.2 脂肪酶产生菌的筛选
• 3 脂肪酶的催化机理及其底物特异性
• 3.1 脂肪酶的催化机理
• 3.2 脂肪酶的底物特异性
• 3.2.1 脂肪酸特异性
• 3.2.2 位置特异性
• 3.2.3 立体特异性
• 4 脂肪酶的活力测定
• 5 脂肪酶的应用
• 5.1 脂肪酶在洗涤剂行业的应用
• 5.2 脂肪酶在食品加工行业的应用
• 5.3 脂肪酶在医药行业的应用
• 5.4 脂肪酶在纺织行业的应用
• 5.5 脂肪酶在饲料行业中的应用
• 5.6 脂肪酶在制备生物柴油方面的应用
• 本研究的立题依据、研究内容及技术路线
• 1 立题依据
• 2 研究内容
• 3 技术路线
• 第二章 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的基因克隆及其序列分析
• 第一节 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶LGY 的基因克隆及序列分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 菌株与质粒
• 1.1.3 酶和生化试剂
• 1.1.4 仪器
• 1.1.5 溶液及培养基配制
• 1.1.5.1 培养基
• 1.1.5.2 溶液配制
• 1.2 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因lgy 的cDNA 克隆
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总RNA 的提取（Trizol 法）
• 1.2.3 紫外检测RNA 产率和纯度
• 1.2.4 反转录cDNA 第一链的合成
• 1.2.5 目的基因cDNA 中间片段的扩增
• 1.2.5.1 目的基因cDNA 中间片段的扩增
• 1.2.5.2 PCR 产物回收
• 1.2.5.3 目的片段与载体连接
• 1.2.5.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
• 1.2.5.4.1 大肠杆菌感受态的制备
• 1.2.5.4.2 大肠杆菌感受态的转化
• 1.2.5.5 重组质粒的筛选与鉴定
• 1.2.5.5.1 IPTG-X-gal 筛选
• 1.2.5.5.2 菌落PCR 检测
• 1.2.5.5.3 碱法小量提取质粒DNA
• 1.2.5.5.4 质粒DNA 的酶切鉴定
• 1.2.5.5.5 序列测定
• 1.2.6 目的基因3’末端的分离（3’RACE）
• 1.3 目的基因DNA 序列和全长cDNA 的克隆
• 1.3.1 引物设计
• 1.3.2 菌丝体DNA 的抽提
• 1.3.3 脂肪酶基因DNA 序列中间片段的PCR 扩增
• 1.3.4 脂肪酶基因DNA 序列5’端片段的TAIL-PCR 扩增
• 1.3.5 脂肪酶基因DNA 与全长cDNA 序列的克隆
• 1.3.6 脂肪酶基因全长序列的生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因lgy 扩增模板的提取
• 2.1.1 疏棉状嗜热丝孢菌总RNA 的提取
• 2.1.2 疏棉状嗜热丝孢菌 Genomic DNA 的提取
• 2.2 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因lgy 全长cDNA 与DNA 序列的扩增
• 2.2.1 脂肪酶基因lgy 中间片段的分离
• 2.2.2 脂肪酶基因lgy cDNA 3’-末端的分离
• 2.2.3 脂肪酶基因lgy DNA 序列5’-末端的分离
• 2.2.4 脂肪酶基因lgy 全长序列的扩增
• 2.3 脂肪酶基因lgy 的核苷酸序列和氨基酸序列分析
• 2.3.1 脂肪酶基因lgy 的核苷酸序列分析
• 2.3.2 脂肪酶基因lgy 的氨基酸序列分析
• 2.3.3 脂肪酶LGY 的立体结构预测
• 第二节 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶LN 的基因克隆及序列分析..
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 总RNA 的提取（Trizol 法）
• 1.2.3 紫外检测RNA 产率和纯度
• 1.2.4 反转录cDNA 第一链的合成
• 1.2.5 目的基因cDNA 中间片段的分离
• 1.2.6 目的基因3’末端的分离（3’-RACE）
• 1.2.7 目的基因ln 全长cDNA 的克隆
• 1.2.8 目的基因ln 的Genomic DNA 序列的扩增
• 1.2.9 目的基因全长序列的生物信息学分析
• 2 结果与分析
• 2.1 目的基因ln 的分离
• 2.1.1 目的基因ln 中间片段的分离
• 2.1.2 目的基因ln cDNA 3’-末端的分离
• 2.1.3 目的基因ln 全长cDNA 的克隆
• 2.1.4 目的基因ln 序列的核苷酸分析
• 2.1.5 目的基因ln 的氨基酸序列分析
• 2.1.6 目的基因ln 的氨基酸序列同源性比较
• 3 讨论
• 3.1 关于研究结果
• 3.2 关于研究方法
• 第三章 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶基因在毕赤酵母中的表达
• 第一节 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LGY 在毕赤酵母中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 酶和生化试剂
• 1.1.3 培养基及有关溶液的配制
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 脂肪酶LGY 成熟肽基因序列的分离
• 1.2.1.1 脂肪酶 LGY 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析
• 1.2.1.2 引物设计以及LGY 成熟肽基因序列的分离
• 1.2.2 脂肪酶基因lgy 在毕赤酵母中的表达
• 1.2.2.1 酵母表达载体的构建
• 1.2.2.2 线性化质粒DNA 的制备
• 1.2.2.3 酵母转化
• 1.2.2.3.1 Pichia pastoris G5115 感受态细胞的制备（电击法）
• 1.2.2.3.2 重组表达质粒pPIC9K/lgy 电击转化酵母感受态细胞
• 1.2.2.4 酵母转化子的筛选与鉴定
• 1.2.2.4.1 酵母转化子甲醇利用表型的平板筛选
• 1.2.2.4.2 酵母基因组DNA 的分离
• 1.2.2.5 酵母转化子的PCR 鉴定
• 1.2.2.5.1 pPIC9K AOX1 通用引物鉴定
• 1.2.2.5.2 脂肪酶lgy 基因的特异性引物鉴定
• 1.2.2.6 外源基因多拷贝整合转化子筛选
• 1.2.2.7 酵母工程菌的培养和脂肪酶LGY 的诱导分泌表达
• 1.2.2.8 表达产物的生物学活性检测
• 1.2.2.9 表达产物的SDS-PAGE 分析
• 1.2.2.10 脂肪酶工程菌产酶曲线及产酶期间生长曲线的测定
• 1.2.2.11 脂肪酶工程菌的遗传稳定性分析
• 1.2.2.12 脂肪酶工程菌表达产物的酶学性质
• 1.2.2.12.1 反应最适温度
• 1.2.2.12.2 反应最适pH 值
• 1.2.2.12.3 热稳定性
• 1.2.2.12.4 pH 稳定性
• 1.2.2.12.5 各种金属离子对脂肪酶活性的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 脂肪酶LGY 成熟肽基因序列的酶切位点分析和扩增
• 2.2 脂肪酶基因lgy 在毕赤酵母中的表达
• 2.2.1 酵母表达载体的构建和鉴定
• 2.2.2 重组酵母表达质粒pPIC9K/lgy 转化 Pichia pastoris GS115及酵母转化子的筛选
• 2.2.2.1 酵母转化子的甲醇利用表型的筛选
• 2.2.2.2 酵母转化子的PCR 鉴定
• 2.2.2.3 lgy 基因多拷贝整合子的筛选
• 2.2.3 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶基因lgy 在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测
• 2.2.3.1 脂肪酶基因lgy 在Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选
• 2.2.3.2 脂肪酶酵母工程菌产酶曲线及产酶期间生长曲线的测定
• 2.2.3.3 脂肪酶基因lgy 表达产物的SDS-PAGE 检测
• 2.2.4 脂肪酶酵母工程菌的遗传稳定性分析
• 2.2.5 表达脂肪酶LGY 的酶学性质研究
• 2.2.5.1 表达脂肪酶LGY 的纯化
• 2.2.5.2 表达脂肪酶LGY 的最适反应温度
• 2.2.5.3 表达脂肪酶LGY 的最适反应pH 值
• 2.2.5.4 表达脂肪酶LGY 的热稳定性
• 2.2.5.5 表达脂肪酶LGY 的pH 稳定性
• 2.2.5.6 金属离子对表达脂肪酶LGY 活性的影响
• 第二节 疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶LN 在毕赤酵母中的表达
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 脂肪酶LN 成熟肽基因序列的分离
• 1.2.1.1 脂肪酶LN 成熟肽基因序列的限制性酶切位点分析
• 1.2.1.2 引物设计以及LN 成熟肽基因序列的分离
• 1.2.2 脂肪酶基因ln 在毕赤酵母中的表达
• 2 结果与分析
• 2.1 脂肪酶LN 成熟肽基因序列的酶切位点分析和扩增
• 2.2 脂肪酶基因ln 在毕赤酵母中的表达
• 2.2.1 酵母表达载体的构建和鉴定
• 2.2.2 重组酵母表达质粒pPIC9K/ln 转化 Pichia pastoris GS115 及酵母转化子的筛选
• 2.2.3 疏棉状嗜热丝孢菌热稳定脂肪酶基因ln 在Pichia pastoris 中的高效表达及表达产物的检测
• 2.2.3.1 脂肪酶基因ln 在Pichia pastoris 中的诱导表达和高表达酵母菌株的筛选
• 2.2.3.2 脂肪酶酵母工程菌产酶曲线的测定
• 2.2.3.3 甲醇的体积分数对脂肪酶产量的影响
• 2.2.3.4 脂肪酶基因ln 表达产物的SDS-PAGE 检测
• 2.2.4 脂肪酶酵母工程菌的遗传稳定性分析
• 2.2.5 表达脂肪酶LN 的酶学性质研究
• 2.2.5.1 表达脂肪酶LN 的纯化
• 2.2.5.2 表达脂肪酶LN 的最适反应温度
• 2.2.5.3 表达脂肪酶LN 的最适反应pH 值
• 2.2.5.4 表达脂肪酶LN 的热稳定性
• 2.2.5.5 表达脂肪酶LN 的pH 稳定性
• 2.2.5.6 金属离子对表达脂肪酶LN 活性的影响
• 3 讨论
• 3.1 关于研究结果
• 3.2 关于表达系统
• 第四章 结论和建议
• 1 结论
• 2 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表论文和申请专利情况