刺参Apostichopus japonicus (Selenka)对温度胁迫响应分子机理的基础研究

论文摘要

以刺参Apostichopus japonicus为研究对象,探讨了温度胁迫下刺参基因表达变化,构建了高温刺激与未经温度刺激的刺参体壁消减cDNA文库,克隆了与温度密切相关的热休克蛋白90和热休克蛋白26基因cDNA全长序列,分析了基因结构,在mRNA水平上研究了两个基因在不同刺激温度、刺激时间及不同组织中的表达情况,并评价了不同群体刺参耐温性状的差异。1.构建了温度胁迫条件下刺参体壁消减cDNA文库。以温度刺激条件下刺参体壁为检测子（tester）,以对照组刺参体壁为驱动子（driver）,经两轮差减杂交,两轮抑制性PCR扩增,获得正向消减文库;以温度刺激条件下刺参体壁为驱动子（driver）,以对照组刺参体壁为检测子（tester）,构建反向消减文库。在正反向文库中随机挑选768个克隆进行PCR扩增鉴定,发现多数克隆都含有插入片段,进一步利用斑点杂交进行筛选,得到737个有差异表达的阳性克隆,经测序共获得165个EST序列,其中65个为已知基因,100个为未知基因。对这些基因进行功能分类,发现正向库中免疫应激相关基因数量明显多于反向库,而能量代谢相关基因明显少于反向库,表明温度胁迫诱导应激防御相关基因的表达,而抑制代谢相关基因的转录。2.克隆了刺参热休克蛋白90（Aphsp90）和热休克蛋白26（Aphsp26）cDNA序列全长。刺参热休克蛋白90（Aphsp90）和热休克蛋白26（Aphsp26）cDNA全长分别为3458bp和1688bp,编码720和236个氨基酸,均为不具有信号肽的胞内蛋白。多重序列比对、系统进化分析显示ApHsp90和ApHsp26氨基酸序列与其他物种Hsp90和sHSPs具有同源性,蛋白质三维结构研究发现这两个氨基酸序列具有Hsp90和sHSPs的特征功能区域,表明获得的cDNA序列为目的基因。3.揭示了热休克蛋白90（Aphsp90）和热休克蛋白26（Aphsp26）基因表达特征。应用RT-PCR检测Aphsp90和Aphsp26基因在不同温度下（20、22、24、26℃）刺参不同组织的表达发现,刺参体壁、呼吸树和肠道中Aphsp90和Aphsp26基因表达发生变化以响应温度胁迫,且响应具有组织差异性。在20℃对照组中,不同组织中基因转录水平高低顺序为刺参肠道>呼吸树>体壁;随着温度的升高,Aphsp90和Aphsp26基因表达量与温度呈现正相关性,在不同组织中都显著升高,肠道中两个基因转录水平变化幅度最大,肠道可能是刺参机体热敏感性较高的组织。基因时序表达结果显示两个基因转录水平与胁迫时间具有较好的正相关性,Aphsp26基因转录水平在胁迫初期（0-6h）显著升高,之后下降,末期恢复到接近对照水平,Aphsp90基因表达量在胁迫4h达到最大值,6h维持在最大值,之后缓慢下降恢复到接近对照水平。4.比较了高温定向选育后南移养殖的浙江群体和烟台野生群体对高温的耐受性。高温（28℃）培育对不同群体幼体存活率、变态率及特定生长率的影响结果显示,在高温条件下两个群体幼体存活率、变态率及特定生长率都比恒温条件（22℃）显著下降,浙江南移群体在高温条件下表现出较好的耐受性,各类指标都高于烟台野生群体。分析了两个群体幼体温度胁迫下的生长趋势,发现随着温度的升高,幼体发育加快,提前进入变态期,浙江幼体在高温条件下最大体长增长,而烟台幼体最大体长缩短。对比不同群体幼参32℃热激17天后的存活率,发现浙江南移群体比烟台野生群体表现出较高的存活率;分析不同群体Aphsp90和Aphsp26基因在28℃热激后的表达情况,结果显示浙江南移群体两个基因转录水平在热激后各个时间点都低于烟台群体,表明刺参耐受性差异与Aphsp90和Aphsp26基因表达模式存在一定的相关性。

论文目录

• 前言
• 摘要
• Abstract
• 第一章 刺参对温度胁迫调节机理的研究进展
• 1.1 温度对刺参生理生态学特征的影响
• 1.1.1 温度对刺参生长发育的影响
• 1.1.2 温度对刺参能量代谢的影响
• 1.1.3 温度对刺参摄食消化的影响
• 1.1.4 温度对刺参免疫机能的影响
• 1.2 水生动物抗逆性的分子生物学研究进展
• 1.2.1 热休克蛋白
• 1.2.2 抗冻蛋白
• 1.2.3 盐度调节基因
• 1.3 抑制性消减杂交技术（SSH）在水生生物抗逆基因筛选中的应用
• 1.3.1 抑制性消减杂交技术原理及步骤
• 1.3.2 抑制性消减杂交技术的优缺点
• 1.3.3 抑制性消减杂交技术的应用
• 1.4 本研究的目的意义及研究思路
• 1.4.1 研究目的及意义
• 1.4.2 研究思路
• 1.5 本章小结
• 第二章 高温胁迫下刺参体壁消减cDNA文库的构建
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 样品采集
• 2.2.2 刺参体壁总RNA的提取
• 2.2.3 m RNA纯化
• 2.2.4 消减杂交
• 2.2.5 消减文库效率检测
• 2.2.6 消减文库的构建
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 不同处理组总RNA及质量评价
• 2.3.2 cDNA合成及酶切纯化
• 2.3.3 抑制性PCR检测
• 2.3.4 消减杂交效果验证
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 高温胁迫下刺参体壁消减cDNA文库的筛选与鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 PCR鉴定消减文库克隆插入片段情况
• 3.2.2 斑点杂交筛选
• 3.2.3 序列测定及功能分析
• 3.2.4 温度刺激条件下刺参体壁中基因表达差异
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 差减cDNA文库容量及插入片段大小
• 3.3.2 斑点杂交
• 3.3.3 差减cDNA片段序列的测定及分析
• 3.3.4 基因功能注释
• 3.3.5 实时定量PCR检测差异表达基因转录水平变化
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 刺参热休克蛋白90 基因的克隆、鉴定与表达分析
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验动物的驯养及样品采集
• 4.2.2 实验相关引物信息
• 4.2.3 刺参总RNA的提取
• 4.2.4 5’-RACE 和3’-RACE cDNA合成
• 4.2.5 3’-RACE扩增
• 4.2.6 5’-RACE扩增
• 4.2.7 ApHsp90 序列同源性比对、遗传进化树分析及空间结构预测
• 4.2.8 Aphsp90 基因在刺参不同组织的时空表达
• 4.2.9 数据分析
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 刺参Aphsp90 全长cDNA克隆及序列分析
• 4.3.2 ApHsp90 序列同源性分析
• 4.3.3 刺参ApHsp90 结构预测
• 4.3.4 刺参ApHsp90 进化分析
• 4.3.5 不同温度条件下Aphsp90 基因在刺参不同组织的表达分析
• 4.3.6 Aphsp90 基因不同刺激时间表达分析
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 刺参热休克蛋白26 基因的克隆、鉴定与表达分析
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验动物的驯养及样品采集
• 5.2.2 实验相关引物信息
• 5.2.3 刺参总RNA的提取
• 5.2.4 5’-RACE 和3’-RACE cDNA合成
• 5.2.5 3’-RACE扩增
• 5.2.6 5’-RACE扩增
• 5.2.7 ApHsp26 序列同源性比对、遗传进化树分析及空间结构预测
• 5.2.8 Aphsp26 基因在刺参不同组织的时空表达
• 5.2.9 数据分析
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 刺参Aphsp26 全长cDNA克隆及序列分析
• 5.3.2 刺参ApHsp26 序列同源性分析
• 5.3.3 刺参ApHsp26 结构预测
• 5.3.4 刺参ApHsp26 进化分析
• 5.3.5 不同温度条件下Aphsp26 基因在刺参不同组织的表达分析
• 5.3.6 Aphsp26 基因不同刺激时间表达分析
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 第六章 不同刺参群体生长及热休克蛋白基因表达差异
• 6.1 前言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验动物的驯养及样品采集
• 6.2.2 高温刺激对不同群体刺参幼体生长发育的影响
• 6.2.3 不同群体刺参幼参生长性能测定
• 6.2.4 不同群体高温耐受性的对比
• 6.2.5 不同选择群体热刺激后Aphsp90 和Aphsp26 表达量的差异
• 6.2.6 数据分析
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 不同群体刺参幼体温度胁迫条件下生长率、存活率分析
• 6.3.2 不同群体刺参幼体温度胁迫条件下生长曲线比较
• 6.3.3 不同群体刺参幼参生长性状的比较
• 6.3.4 不同群体幼参耐温性能差异
• 6.3.5 高温刺激下不同群体幼参 Aphsp90 及 Aphsp26 表达量差异
• 6.4 讨论
• 6.5 本章小结
• 第七章 总结与展望
• 7.1 研究总结
• 7.2 创新性
• 7.3 存在的问题
• 7.4 研究展望
• 参考文献
• 博士期间撰写及发表文章情况
• 致谢