高通量慢病毒RNA干扰载体构建方法的研究

高通量慢病毒RNA干扰载体构建方法的研究

论文摘要

由于人类基因组计划的完成和蛋白质组学研究的开展,对于基因功能的研究不再以单一基因为对象,更为普遍的是采用系统性的研究方法,以全基因组为对象进行功能解析。因此,更为有效的、高通量的基因功能研究手段在近年来得到越来越多的重视。其中大规模的RNAi文库成为在全基因组规模系统研究基因功能的强有力工具。RNAi文库是人工构建的能通过RNAi机制诱导众多不同基因表达的组合文库。通过RNAi文库可以同时对多个基因的表达水平进行下调,从而研究其对应蛋白的功能。由于shRNA的特殊茎环结构,目前构建shRNA载体的方法大多需要合成长的引物,因此重组质粒突变率高且载体构建成本高。同时,由于插入片段小,克隆重组子筛选工作复杂。为了高通量构建shRNA表达载体,本研究发展了一个新的不依赖连接酶的shRNA表达载体构建方法。首先在载体克隆位点设计切刻酶位点Nb.BbvCI和限制性内切酶位点BfuI的组合,载体经这两种酶酶切后,线性化载体的克隆位点会带有长的粘性末端(12bp)。然后设计针对干扰单元靶点的一对引物,引物两端带上与载体粘性末端互补的序列,同时让引物在体外条件下退火。最后引物退火产物与线性化载体在体外条件下孵育,互补的粘性末端退火形成环状分子,经转化进大肠杆菌细胞后,细菌的修复系统修复突出的缺口而得到正确的重组子,即我们需要的shRNA重组载体。这种构建shRNA载体的方法不需要目的DNA的纯化、酶切和连接,不需要合成传统方法所需的长引物(约60bp)。本研究用这种新方法成功构建了20个shRNA重组载体,实验结果表明该方法克隆效率高于90%,构建的shRNA重组载体测序准确率在85%以上。我们应用本方法构建了针对p53和egfp基因的shRNA重组质粒载体,并检测重组质粒载体表达的siRNA的干扰效果,实验结果表明,用本实验构建的shRNA重组载体具有理想的干扰效果。在此基础上,我们将该方法运用于慢病毒shRNA载体的构建,成功构建了6个shRNA重组慢病毒载体。在进一步的研究中,我们计划大量构建shRNA重组慢病毒载体并检测重组慢病毒载体的干扰效果。从而达到构建慢病毒shRNA表达载体文库的目的。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 第一部分 文献综述
  • 1.1 RNAi研究概述
  • 1.1.1 RNAi作用机制
  • 1.1.2 RNAi的生物学意义
  • 1.1.3 RNAi的应用
  • 1.1.4 RNAi技术进展
  • 1.1.5 RNAi文库简介
  • 1.2 慢病毒及慢病毒介导的RNAi简介
  • 1.2.1 慢病毒
  • 1.2.2 慢病毒载体介导的RNAi
  • 1.3 本研究的的目的
  • 第二部分 材料和方法
  • 2.1 材料
  • 2.1.1 菌株和质粒
  • 2.1.2 细胞系
  • 2.1.3 培养基配方及配制
  • 2.1.4 主要引物
  • 2.1.5 主要试剂
  • 2.1.6 主要缓冲液
  • 2.1.7 仪器和设备
  • 2.2 方法
  • 2.2.1 SDS碱裂解法制备质粒DNA(小量制备)
  • 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
  • 2.2.3 大肠杆菌的转化
  • 2.2.4 PCR反应体系
  • 2.2.5 SDS-PAGE电泳
  • 2.2.6 哺乳动物细胞的冻存和复苏
  • 2.2.7 哺乳动物细胞HEK293FT、HEK 293T、Hela等细胞系的传代培养
  • 2.2.8 RT-PCR检测目的基因mRNA的表达量
  • 2.2.9 蛋白质印记(Western blot)检测目的基因蛋白质的表达量
  • 2.2.10 质粒DNA转染哺乳动物细胞
  • 2.2.11 慢病毒包装简要程序
  • 2.2.12 慢病毒滴度的测定
  • 第三部分 结果与分析
  • 3.1 LIC法构建shRNA重组质粒载体的策略
  • 3.1.1 shRNA重组质粒载体的构建和鉴定
  • 3.1.1.1 用于表达shRNA的质粒载体的构建
  • 3.1.1.2 shRNA重组质粒载体的构建
  • 3.1.1.3 shRNA重组质粒载体的克隆效率与测序结果
  • 3.1.2 shRNA重组质粒载体干扰效果的检测
  • 3.1.2.1 在mRNA水平上检测shRNA重组质粒载体的干扰效果
  • 3.1.2.2 在蛋白表达水平上检测shRNA重组质粒载体的干扰效果
  • 3.2 LIC法构建shRNA慢病毒表达载体策略
  • 3.2.1 shRNA重组慢病毒载体的构建和鉴定
  • 3.2.1.1 用于表达shRNA的慢病毒载体的构建
  • 3.2.1.2 重组shRNA慢病毒载体的构建
  • 3.2.1.3 shRNA重组慢病毒载体的克隆效率及测序结果
  • 3.2.2 重组慢病毒的包装和感染
  • 3.2.2.1 重组慢病毒的包装
  • 3.2.2.2 重组慢病毒的感染
  • 第四部分 讨论与展望
  • 4.1 讨论
  • 4.1.1 本研究LIC克隆方法的原理
  • 4.1.2 该方法克隆操作简单
  • 4.1.3 该方法克隆效率高
  • 4.1.4 该方法测序突变率低
  • 4.1.5 该方法重组子筛选方式简便
  • 4.1.6 该方法构建的干扰载体实用
  • 4.2 展望
  • 参考文献
  • 附录:攻读学位期间获得的研究成果
  • 致谢
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