论文摘要
新城疫病毒（newcastle disease virus,NDV）是不分段的、单股负链RNA病毒,属副粘病毒科腮腺炎病毒属。NDV具有天然的在人肿瘤细胞选择性复制的特点,由于对人类无致病原性,近年来在肿瘤治疗方面的应用得到关注。目前NDV用于肿瘤治疗主要集中在两个方面:1)在临床上用弱毒株NDV感染患者自体肿瘤细胞制成瘤苗,对患者进行术后主动免疫治疗。2)利用强毒株NDV直接进行肿瘤的病毒治疗以及将其作为载体携带外源基因用于基因治疗。NDV的RNA基因组全长约15kb,包含6个基因,其中编码的血凝素-神经氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase, HN）和融合蛋白（fusion protein,F）表达在病毒的包膜上。HN蛋白的功能体现在三个方面:①受体识别:识别宿主细胞表面含唾液酸的糖蛋白受体,介导病毒颗粒吸附于靶细胞膜上,从而启动感染过程;②神经氨酸酶活性:能水解宿主细胞内新合成糖蛋白上的唾液酸,因此在病毒复制周期中能抑制新合成病毒颗粒的聚集以及促进新合成病毒粒子从感染的细胞中释放。③促膜融合:和F蛋白相互作用,激活F蛋白的促膜融合作用,最终NDV膜和靶细胞膜相互融合,导致病毒进入胞浆复制。F蛋白除了促膜融合作用外,其氨基酸序列对病毒毒力也有很大影响。基于HN和F蛋白相互作用具有促进细胞膜融合的作用,本课题研究的主要目的是:通过表达NDV Italien株的HN和F蛋白,研究他们各自的功能及相互作用,进一步研究HN和F蛋白共表达对肝癌细胞的促膜融合作用,为肝癌的治疗提供新思路。本课题共分三个部分:①构建NDV Italien株的HN基因的真核表达载体,通过western blot、免疫荧光技术鉴定HN蛋白的表达,进一步检测HN蛋白的促红细胞凝集功能和神经氨酸酶活性。②构建NDV Italien株的F基因的真核表达载体,通过免疫荧光技术鉴定F蛋白的表达,通过将HN和F真核表达载体共转染COS-7细胞,用苏木精染色法检测F蛋白的促膜融合作用。③通过将HN和F真核表达载体共转染HHCC细胞,用苏木精染色法检测HN和F蛋白相互作用对肝癌细胞HHCC的多核融合作用。我们首先通过RT-PCR的方法克隆了NDV Italien株的HN和F基因,并各自分别引入了EcoR V和Xbal I两个酶切位点,连接T载体、测序。然后通过分别双酶切HN、F基因和真核表达载体pcDNA3.1,将HN、F基因连入到pcDNA3.1载体中,通过PCR和酶切鉴定证明,HN和F基因正确地连入到pcDNA3.1载体中,分别命名为pcDNA3.1-HN和pcDNA3.1-F。将构建的两个真核质粒分别转染COS-7细胞,western blot、免疫荧光显微镜技术证明HN和F蛋白都在COS-7细胞中得到了瞬时表达。功能试验结果表明,HN蛋白具有促红细胞凝集和神经氨酸酶的功能,HN和F蛋白相互作用具有促膜融合的功能。进一步将HN和F共转染肝癌细胞HHCC,结果证明HN和F蛋白具有促使肝癌细胞HHCC膜融合,形成多核细胞的功能。