无指盘臭蛙和山溪鲵皮肤及卵中3种生物活性多肽的分离鉴定和克隆

论文摘要

两栖类动物属于一类可持续利用的自然资源，它们具有多种多样的科研及利用价值。此外，它们的组织中含有大量的分子结构特殊、功能复杂多样的生物活性物质，它们是有待于开发的资源宝库。中国拥有丰富的两栖类动物资源，共有284个种（亚种），其中2／3是特有种类，它是我国生物资源的重要组成部分，也是人类的宝贵财富，对我国两栖类动物资源的开发利用有很大的潜力。目前，已分离鉴定出许多具有各种生物活性的蛋白及多肽。我们收集分布于中国西南境内的2种常见的药用、食用两栖类：山溪鲵（Batrachuperus pachunii）及无指盘臭蛙（Rana grahami），并对这2种两栖类皮肤分泌液及其卵进行了如下一系列的生物活性筛选研究：（1）以发色底物对2种两栖类动物皮肤分泌液进行丝氨酸蛋白酶水解活性和丝氨酸蛋白酶抑制剂活性测定，山溪鲵皮肤分泌液无丝氨酸蛋白酶水解活性，无指盘臭蛙皮肤分泌液及卵匀浆液显示较强的丝氨酸蛋白酶抑制剂活性；（2） 2种两栖类皮肤分泌液具有较强的抗菌活性，而其卵匀浆液则无明显抗菌作用；（3） 2种两栖类的皮肤分泌液不具备出血活性，无指盘臭蛙卵匀浆液显示较弱的溶血活性，而山溪鲵卵匀浆液无溶血活性。（4） 2种两栖类皮肤分泌液及其卵匀浆液对正常人血浆的复钙时间没有明显的影响，即它们对正常人血液没有明显的促凝和抗凝作用。进一步通过生物化学，分子生物学手段和研究方法，分别从2种两栖动物皮肤分泌液或卵匀浆液中，我们得到了3种生物活性多肽类或蛋白类物质，包括两个抗菌肽、两个丝氨酸蛋白酶抑制剂及β-microseminoprotein样蛋白。并分别对这几类活性多肽类或蛋白类物质进行了进一步研究。通过Sephadex G-50凝胶过滤、反相高压液相等生化技术手段，从无指盘臭蛙皮肤分泌波中得到两个具有广谱抗菌活性的抗菌肽。该两个抗菌肽被命名grahamin 1 and grahamin 2。Edman降解法测序结果grahamin 1的氨基酸序列为GLLSGILGAGKNIVCG LSGLC；grahamin 2的氨基酸序列为GLLSGILGAGKHIVCGLSGLC；快原子轰击质谱分析表明，grahamin 1及grahamin 2的分子量分别为1942Da和1965Da，结果与理论分子量（1942.5Da和1965.6Da）基本相符。grahamin 1及grahamin 2氨基酸序列比较分

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摘要

ABSTRACT

第一篇：文献综述

第一章两栖类动物的活性物质及资源利用

1 两栖类动物皮肤中的活性物质的组成

2 国际上两栖类动物药用资源的开发利用现状

3 我国两栖类动物资源的研究利用现状

4 中国两栖类动物资源研究与开发利用策略

参考文献

第二章两栖类抗菌肽的研究进展

1 两栖类动物抗菌肽的研究概况

2 两栖类抗菌肽的理化性质及结构

2.1 两栖类抗菌肽的理化性质

2.2 两栖类抗菌肽结构类型

2.3 两栖类抗菌肽的分子结构

2.4 两栖类抗菌肽基因表达及cDNA编码特点

3 两栖类抗菌肽作用机理

4 两栖类抗菌肽的功能

4.1 抗菌活性

4.2 抗肿瘤活性

4.3 抗病毒活性

4.4 抗原虫活性

4.5 抗精子作用

4.6 胚胎毒性

4.7 溶血活性

4.8 细胞调亡活性

4.9 其他活性

5 两栖类抗菌肽的应用

5.1 两栖类抗菌多肽的应用

5.2 两栖类抗菌多肽作为临床药物的优点与局限

6 研究展望

第三章蛋白酶抑制剂研究进展

1 丝氨酸蛋白酶抑制剂分类

2 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构及抑制机理

2.1 典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂

2.2 非典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂

2.3 Serpins

3 两栖类动物丝氨酸蛋白酶抑制剂研究进展

4 丝氨酸蛋白酶抑制剂的展望

参考文献

第二篇：实验研究

第四章两种两栖动物皮肤及卵活性物质检测及生化性质

1 前言

2 材料及方法

2.1 实验材料

2.2 处理和样品收集方法

2.3 蛋白酶水解活性研究

2.4 丝氨酸蛋白酶抑制剂活性检测

2.5 抗菌活性检测

2.6 溶血及血液凝固活性检测

2.7 血小板聚集活性检测

2.8 血小板聚集抑制活性检测

2.9 蛋白浓度测定

3 结果与分析

3.1 蛋白酶水解活性研究

3.2 抗菌活性检测

3.3 溶血及血液凝固活性研究

3.4 胰蛋白酶抑制剂活性测定

3.5 血小板聚集活性检测

3.6 血小板聚集抑制活性检测

4 讨论

参考文献

第五章无指盘臭蛙皮肤分泌液中抗菌肽研究

1 前言

2 材料和方法

2.1 无指盘臭蛙皮肤分泌液的收集

2.2 抗菌活性检测

2.3 分离纯化

2.4 结构研究

2.5 溶血活性检测

2.6 分子克隆

3 结果及分析

3.1 分离纯化

3.2 两种抗菌肽的氨基酸序列分析

3.3 抗菌肽的分子克隆

3.5 溶血活性

4 讨论

参考文献

第六章无指盘臭蛙卵丝氨酸蛋白酶抑制剂的分离纯化和部分性质

1 前言

2 材料及方法

2.1 材料

2.2 分离纯化

2.3 SDS-PAGE及分子量测定

2.4 N-末端序列测定及序列分析

2.5 无指盘臭蛙卵丝氨酸蛋白酶抑制剂活性检测及抑制常数确定

2.6 无指盘臭蛙卵的丝氨酸蛋白酶抑制剂的热及酸碱稳定性

2.7 蛋白浓度测定

3 结果及分析

3.1 无指盘臭蛙卵丝氨酸蛋白酶抑制剂分离纯化

2.2 SDS-PAGE电泳行为及质谱分析

2.3 N-末端序列分析

2.4 无指盘臭蛙卵丝氨酸蛋白酶抑制剂活性检测及抑制常数的确定

2.5 无指盘臭蛙卵的丝氨酸蛋白酶抑制剂的热及酸碱稳定性

3 讨论

参考文献

第七章山溪鲵皮肤分泌液β-microseminoprotein样蛋白的分离纯化及其cDNA基因的克隆

1 前言

2 材料及方法

2.1 实验材料

2.2 生化试剂及仪器

2.3 分离纯化

2.4 SDS-PAGE及分子量测定

2.5 N-末端序列测定及序列分析

2.6 cDNA序列的分子克隆

2.7 目的片段连接载体、转化、分子克隆及其序列测定和比较

3 结果与分析

3.1 分离纯化

3.2 N-末端序列测定

3.3 cDNA序列及氨基酸序列分析

4 讨论

参考文献

全文结论

本研究创新点

附录：实验试剂及配置

致谢

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无指盘臭蛙和山溪鲵皮肤及卵中3种生物活性多肽的分离鉴定和克隆

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