壳聚糖/pUNO-mSIGIRR纳米粒对小鼠实验性结肠炎的治疗作用及其机制研究

论文摘要

背景与目的炎症性肠病（IBD）的病因和发病机制目前尚不清楚,已确认Toll样受体（TLR）信号通路过度激活导致异常的免疫炎症反应从中起重要作用,然而TLR信号通路过度激活的具体机制目前不明。SIGIRR是新近发现的TLR信号通路的负性调控因子,对TLR致炎信号通路有“刹车”作用,可减轻炎症反应,但作用机制不详。有研究表明SIGIRR在IBD表达低下,但是SIGIRR在IBD发病中的作用机制及它可否抑制IBD时TLR信号通路的过度激活、减轻炎症反应,尚无研究报道。壳聚糖纳米粒是一种无毒的基因传输载体材料。为此,本研究在小鼠实验性结肠炎模型中研究了SIGIRR和TLR信号通路变化及它们的相互关系,并运用新型基因输送载体壳聚糖纳米粒装载编码SIGIRR的外源性基因肠道给药,观察它对小鼠实验性结肠炎TLR信号通路的影响,阐明SIGIRR对IBD是否有治疗作用及其可能的机制,为IBD的治疗提供新的靶点和方向。方法1.壳聚糖/pUNO-mSIGIRR和壳聚糖/pUNO纳米粒的制备:①用质粒提取试剂盒提取pUNO-mSIGIRR和pUNO质粒;②采用复凝聚法制备壳聚糖纳米粒,根据影响纳米粒制备的壳聚糖溶液浓度、pH值、质粒DNA浓度、Na2SO4浓度及涡旋时间五个因素,优化制备条件。③用透射电子显微镜观察纳米粒的形态;纳米粒度仪测量纳米粒的粒径;用荧光光度分光计测定混悬液中游离DNA的量,并计算其包裹率。2.实验分组:①对照组:未建模的小鼠仅给予生理盐水灌肠;②模型组:建模的小鼠仅给予生理盐水灌肠;③空质粒组:建模的小鼠给予全量壳聚糖/pUNO纳米粒灌肠;④半量组:建模的小鼠给予用生理盐水等体积稀释的壳聚糖/pUNO-mSIGIRR纳米粒灌肠;⑤全量组:建模的小鼠给予全量壳聚糖/pUNO-mSIGIRR纳米粒灌肠。每组7只小鼠,每次0.1ml灌肠。3. DSS诱导小鼠结肠炎模型的建立和药物治疗:BALB/c小鼠自由饮用5%DSS溶液7天,建立小鼠急性结肠炎模型,模型建立成功标志为:体重下降、腹泻、大便隐血阳性或肉眼血便中的任一症状。将未造模的仅给予生理盐水灌肠的小鼠作为对照组。在造模第2天开始,分别按上述分组的药物剂量给药,每天1次,直至实验结束。处死小鼠,取标本待测。4.各项指标的观察和检测:①观察每天各组小鼠体重、疾病活动指数DAI;②肉眼观察小鼠结肠大体形态改变,HE染色观察病理组织学改变;③RT-PCR方法检测小鼠结肠组织中SIGIRR mRNA的表达;④免疫组织化学染色检测小鼠结肠组织中TLR4、MyD88、SIGIRR和NF-κB p65蛋白的表达。结果:1.壳聚糖纳米粒的制备及理化性质研究根据影响壳聚糖/pUNO-mSIGIRR和壳聚糖/pUNO纳米粒制备的因素,得到的优化条件为:壳聚糖浓度、PH值、质粒DNA浓度、NaSO4浓度、涡旋时间分别为300ug/ml、5.5、100ug/ml、8 mM、30sec。用此条件制备得到的纳米粒:①用透射电子显微镜观察了纳米粒的形态,大多数纳米粒呈球形,形态比较规则,且绝大多数粒子的直径在100nm以下;②用纳米粒度仪测定了壳聚糖/pUNO-mSIGIRR的ZAve平均径、强度平均径、数目平均径、体积平均径及多分散度,结果分别为213.8nm、215.8nm、80.43nm、104nm和0.466。壳聚糖/pUNO纳米粒的测定结果分别为:269.6nm、366.6nm、67.74nm、450.4nm和0.251;③用荧光光度分光计测定混悬液中游离DNA的含量,计算包裹率为99.9%。2.壳聚糖/pUNO-mSIGIRR对小鼠实验性结肠炎的治疗作用及其机制研究（1）小鼠体重及DAI积分变化①除对照组外各组小鼠在造模后体重开始下降,实验第5天体重下降至最低点,随后逐渐回升。在实验第5、10天模型组和各药物组体重下降百分比均高于对照组（P<0.001,0.05）;在实验第5天和第10天半量和全量组小鼠体重下降均低于模型组和空质粒组,但无统计学意义（P>0.05）,半量和全量组间差异无统计学意义（P>0.05）。②各组小鼠DAI积分在实验第5、10天有显著差异,对照组的DAI积分显著低于模型组和各药物组（P<0.001）;实验第5天半量组和全量组显著低于模型组（P<0.05）,半量和全量组低于空质粒组,但无统计学意义（P>0.05）;在实验第10天半量组和全量组低于模型组和空质粒组,但无统计学意义（P>0.05）。（2）小鼠结肠病理学改变①小鼠肠黏膜大体形态:对照组小鼠结肠黏膜未见充血、水肿、糜烂和溃疡,模型组和空质粒组可见结肠黏膜明显充血、水肿和糜烂;半量及全量组结肠黏膜充血、水肿和糜烂较模型组及空质粒组明显改善。②小鼠结肠病理组织学严重度评分:无论是结肠炎症程度、病变深度和隐窝破坏,对照组均显著低于模型组及各药物组（P<0.001,0.005,0.05）;半量及全量组均显著低于模型组和空质粒组（P<0.01,0.05）,半量和全量组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（3）小鼠结肠黏膜SIGIRR表达SIGIRR mRNA的表达:对照组显著高于模型组和空质粒组（P<0.05）,半量和全量组显著高于模型组和空质粒组（P<0.001,0.05）,半量和全量组较对照组升高,但无统计学意义（P>0.05）,全量组较半量组升高,但无统计学意义（P>0.05）。SIGIRR蛋白在腺细胞中表达:对照组显著高于模型组和空质粒组（P<0.001）,半量和全量组显著高于模型组和空质粒组（P<0.001）,半量和全量组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（4）小鼠结肠黏膜TLR4表达TLR4蛋白在腺细胞中表达:对照组显著低于模型组和空质粒组（P<0.001）,半量和全量组显著低于模型组（P<0.05）,全量组显著低于空质粒组（P<0.05）。TLR4蛋白在炎细胞中的表达:对照组显著低于模型组和各药物组（P<0.001,0.01）,半量和全量组显著低于模型组和空质粒组（P<0.05）,半量和全量组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（5）小鼠结肠黏膜MyD88表达MyD88蛋白在腺细胞和炎细胞中表达:对照组显著低于模型组和各药物组（P<0.001,0.05）,半量和全量组显著低于模型组和空质粒组（P<0.001,0.05）,半量和全量组之间差异无统计学意义（P>0.05）。（6）小鼠结肠黏膜NF-κB p65表达NF-κB p65蛋白在炎细胞中表达:对照组显著低于模型组和各给药组（P<0.001,0.05）,半量和全量组显著低于模型组和空质粒组（P<0.001,0.05）,半量和全量组之间差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.本研究运用复凝法制备的壳聚糖/pUNO-mSIGIRR纳米粒其ZAve平均径、强度平均径、数目平均径、体积平均径、多分散度和包裹率符合基因治疗载体的要求。2.本研究制备的壳聚糖/pUNO-mSIGIRR纳米粒经肠道给药后,小鼠肠黏膜SIGIRR mRNA和蛋白的表达较模型组和空质粒组升高,提示SIGIRR基因进入细胞并表达,说明壳聚糖纳米粒可作为基因输送载体用于基因治疗。3. DSS诱导的实验性结肠炎小鼠肠黏膜SIGIRR的表达降低,TLR4、MyD88、NF-κB p65表达增加,提示TLRs/NF-κB信号通路过度活化和它的负性调控机制的减弱参与了IBD的致病。4.壳聚糖/pUNO-mSIGIRR纳米粒可减轻实验性结肠炎小鼠的症状、肠黏膜炎症和病理损伤,有望成为治疗IBD的新途径。5.壳聚糖/pUNO-mSIGIRR纳米粒可下调实验性结肠炎小鼠肠黏膜中TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达,并与结肠炎症的缓解有关,提示SIGIRR可能通过抑制TLRs/NF-κB信号通路的激活减轻组织炎症反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 壳聚糖/pUNO-mSIGIRR 纳米粒的制备及理化性质研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 提取质粒的酶切及PCR 鉴定
• 2.2.2 经筛选优化的壳聚糖纳米粒的制备条件的选取
• 2.2.3 透射电子显微镜观察结果
• 2.2.4 粒径和多分散度结果
• 2.2.5 包裹率结果
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 第3章 壳聚糖/pUNO-mSIGIRR 纳米粒对小鼠实验性结肠炎的治疗作用及其机制
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.3 统计学处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 各组小鼠体重变化及DAI 积分
• 3.2.2 小鼠肠黏膜大体形态
• 3.2.3 小鼠结肠组织病理变化
• 3.2.4 小鼠结肠黏膜SIGIRR m RNA 表达的变化
• 3.2.5 小鼠结肠黏膜TLR4、MyD88、SIGIRR 和NF-κB p65 蛋白表达的变化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 DSS 诱导小鼠实验性结肠炎肠黏膜中TLR4、MyD88、SIGIRR 和NF-κB P65 的表达
• 3.3.2 壳聚糖作为SIGIRR 基因递送载体的研究
• 3.3.3 SIGIRR 对DSS 诱导的小鼠实验性结肠炎的治疗作用及其机制
• 3.4 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 附带综述