奶牛乳腺上皮细胞系的建立及生理功能鉴定

论文摘要

本试验采用组织块法分离培养奶牛乳腺上皮细胞,采用多种方法纯化细胞,且对纯化的上皮细胞形态学和生理功能进行鉴定,并以十六代细胞为材料,应用实时（?）定量PCR检测奶牛乳腺上皮细胞在脂多糖刺激下,细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达,并研究了催乳激素和赖氨酸处理时乳蛋白合成和分泌功能,结果说明本试验培养的细胞具有正常的乳腺上皮细胞功能,为进一步研究建立具有正常功能的永生化奶牛乳腺上皮细胞系奠定基础。试验一用组织块培养法获得大量奶牛的原代乳腺上皮细胞,联合运用刮除法、相差消化和相差贴壁法、单克隆法可获得纯化的、活力旺盛的乳腺上皮细胞,且在体外可连续传代二十五代以上,但随着细胞超过二十五代以后增殖活力有所下降。应用荧光免疫组化、核型分析和p-酪蛋白表达检测了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征和乳蛋白表达,同时检测到细胞角蛋白18的表达,并鉴定为上皮细胞；此外,研究还发现在不添加催乳激素的情况下,检测到乳腺上皮细胞能够表达较低的β-酪蛋白,实现了奶牛乳腺上皮细胞系的建立。试验二初步筛选出脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞的适宜浓度,再以该浓度刺激细胞,通过RT-PCR法检测细胞因子IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达,试验结果表明：脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞24h后,IL-6、IL-8表达量显著升高（P<0.05）；TNF-α在脂多糖刺激后4h表达量达最高（P<0.05）。研究表明,该细胞可作为研究奶牛乳房炎病理机制以及细胞免疫作用的模型。试验三催乳素、氢化可的松和胰岛素不同组合刺激奶牛乳腺上皮细胞,采用相对实时荧光定量法检测β-酪蛋白、α-乳白蛋白和乳铁蛋白的mRNA表达。结果表明：在三种激素均添加的情况下,三种蛋白表达量最高（P<0.05）；而在不同组合的基础上添加赖氨酸,三种蛋白表达量有上升的趋势,但变化不明显。此外,采用ELISA法在蛋白水平上进行验证,结果与mRNA表达水平一致。说明本实验所获得的奶牛乳腺上皮细胞系并未发生转化,具有正常的生理功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 乳腺上皮细胞系培养研究进展
• 1.1 牛乳腺上皮细胞培养及细胞系建立的研究进展
• 1.2 永生化细胞系建立的机制
• 1.2.1 病毒转染
• 1.2.2 原癌基因介导
• 1.2.3 p53突变体
• 1.2.4 端粒酶
• 1.2.5 放射性因素
• 2 乳腺相关细胞因子的研究进展及表达调控
• 2.1 脂多糖在治疗乳房炎中的应用及其机理
• 2.2 与脂多糖相关的细胞因子
• 2.2.1 肿瘤坏死因子
• 2.2.2 白细胞介素
• 2.2.3 集落刺激因子
• 2.2.4 干扰素
• 2.3 脂多糖在乳腺细胞中研究进展
• 3 催乳激素及赖氨酸对乳腺相关功能基因表达的调控及其机制
• 3.1 催乳激素对乳腺的刺激作用及其机理
• 3.2 激素和赖氨酸互作效应对乳腺吸收氨基酸的作用及机理
• 4 本论文的研究意义及主要内容
• 试验一 奶牛乳腺上皮细胞的体外培养与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 试剂与材料
• 1.1.1 组织来源
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 有关试剂的配置
• 1.1.4 试验仪器
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养
• 1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化
• 1.2.3 奶牛乳腺上皮细胞的传代
• 1.2.4 细胞生长曲线的测定
• 1.2.5 乳腺上皮细胞的形态学鉴定
• 1.2.6 细胞角蛋白18的免疫荧光检测
• 1.2.7 奶牛乳腺上皮细胞染色体核型分析
• 1.2.8 奶牛乳腺上皮细胞表达β-酪蛋白基因的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及形态学观察
• 2.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化与传代
• 2.3 奶牛乳腺上皮细胞生长特性
• 2.4 奶牛乳腺上皮细胞的荧光免疫鉴定
• 2.5 奶牛乳腺上皮细胞染色体核型分析
• 2.6 奶牛乳腺上皮细胞表达β-酪蛋白基因的鉴定
• 3 讨论
• 3.1 奶牛乳腺上皮细胞的生长特性
• 3.2 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法
• 3.3 奶牛乳腺上皮细胞的纯化与传代
• 3.4 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定方法
• 4 小结
• 试验二 脂多糖刺激奶牛乳腺上皮细胞IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂和器材
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 刺激用液
• 1.1.3 试验仪器
• 1.2 试验步骤
• 1.2.1 试验用的细胞
• 1.2.2 LPS刺激培养
• 1.2.3 RNA提取
• 1.2.4 RNA检测
• 1.2.5 RT-PCR检测细胞因子的mRNA表达
• 1.2.6 凝胶电泳
• 1.2.7 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA浓度和完整性
• 2.2 IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达随LPS浓度变化关系
• 2.3 IL-6、IL-8及TNF-α的mRNA表达随时间变化关系
• 3 讨论
• 4 小结
• 试验三 催乳激素和赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞分泌乳蛋白的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 试剂和器材
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 有关试剂的配置
• 1.1.3 试验器材
• 1.2 试验步骤
• 1.2.1 催乳激素刺激奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白的mRNA表达
• 1.2.2 RT-qPCR
• 1.2.3 催乳激素和赖氨酸组合刺激对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白的mRNA表达影响
• 1.2.4 ELISA法检测细胞上清液中β-酪蛋白和乳铁蛋白的含量
• 1.2.5 数据处理
• 2 结果与分析
• 2.1 催乳激素和赖氨酸刺激奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白的mRNA表达影响
• 2.2 ELISA法检测细胞上清液中β-酪蛋白和乳铁蛋白的表达
• 3 讨论
• 3.1 催乳激素对奶牛乳腺上皮细胞表达乳蛋白的影响
• 3.2 赖氨酸对奶牛乳腺上皮细胞表达乳蛋白的影响
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录