大熊猫Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆表达及胃和脾脏cDNA文库的构建

论文摘要

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是我国特有的国家Ⅰ一级重点保护野生动物,被誉为动物界的“活化石”。由于大熊猫自身的食性、繁殖能力和育幼行为的高度特化等原因,造成了大熊猫目前濒危状态,野生大熊猫现在仅存1600只左右。哺乳动物的繁殖和生长与营养状况密切相关,Leptin和Ghrelin就是将摄食、能量代谢和生殖生长联系起来的关键激素。由于对大熊猫生殖力低和初生幼仔发育不良的分子机制的研究还很薄弱,对大熊猫生长发育、疾病、繁殖相关基因（如GH、Leptin、Ghrelin和IL-15等基因）的克隆,对了解大熊猫生长发育规律,青春期发动,繁殖规律以及野外大熊猫的人工救助和保护具有重要的意义。大熊猫种群的规模小,遗传资源的枯竭和遗传退化都不利于种群的复壮与重建,尽快建立大熊猫的基因文库（包括cDNA文库与基因组文库等）不失为一种有效保存现有遗传资源的方法。本研究的目的就是克隆大熊猫Ghrelin、Leptin和IL-15等功能基因,并在原核和真核表达系统中实现表达;构建胃和脾脏等全长cDNA文库,为研究这些基因在大熊猫发育、繁殖中的作用及大熊猫基因资源的保存提供支持。本研究获得以下主要结果:1.克隆了大熊猫Ghrelin、Leptin和Interleukin-15的全长编码区,并鉴定得到Ghrelin和Leptin的两种不同mRNA剪接体。Ghrelin和Ghrelin-des-Gln14基因编码区序列为354bp和351bp,分别编码117和116氨基酸的前体蛋白,成熟蛋白分别为28和27个氨基酸;Leptin和Leptin-3-deleted编码区序列为504bp和501bp,分别编码167和166氨基酸的前体蛋白,成熟蛋白为146和145氨基酸;IL-15基因编码区序列为489bp,编码一个162氨基酸的前体蛋白,成熟蛋白为114氨基酸。氨基酸序列分析表明,大熊猫Ghrelin,与猫和狗的氨基酸序列相似性最高,分别高达90.6%和86.3%;Leptin与熊、狗和猫的相似性高达99.4%、94.6%和92.8%;IL-15与狗、猫的相似性高达87.0%和82.7%。以上表明大熊猫三个基因在进化上可能与狗、熊和猫亲缘关系最近。Leptin和IL15蛋白质结构模拟结果表明,大熊猫IL15的三级结构跟人的高度相似;尽管大熊猫Leptin蛋白保守域跟人的完全相同,但三级结构与人的有较大差异。2.建立了大熊猫基因在大肠杆菌原核表达和酵母真核表达体系,首先以大熊猫GH基因进行了酵母真核分泌表达体系的建立,并系统的优化了GH分泌表达的条件,探索了用硫酸铵分级沉淀纯化表达产物的方法;然后采用优化的表达系统和纯化方法,实现了大熊猫Leptin和Interleukin-15在酵母表达系统中高效表达,用亲和柱对表达蛋白的纯化。Leptin基因含有5个AGG,1个AGA,1个ATA;IL-15基因含有3个ATA,一个TGT。这些密码子都是大肠杆菌稀有密码子。在单独使用BL21（DE3）-pET28a-gene表达系统时,菌株会生长会受到抑制,很难获得表达。本研究将质粒pSJS1240和pET28a-Leptin或pET28a-IL15共转化到E.coli BL21（DE3）菌株,kan和SP抗生素筛选,得到过表达菌株BL21（DE3）（pSJS1240/pET28a-Leptin）和BL21（DE3）（pSJS1240/pET28a-IL15）,使这两个含大量稀有密码子的基因在大肠杆菌中获得成功表达;为这三个大熊猫基因的体外表达创建了技术平台,为深入研究基因功能奠定了基础。3.用RT-PCR方法检测了Ghrelin在小肠、肝脏、肾脏、胸腺、脾脏和心脏组织的mRNA表达,表明大熊猫Ghrelin的最主要表达组织是胃,在小肠、肝脏和肾脏中只有较弱表达,而在胸腺、脾脏和心脏组织中没有检测到该基因的表达。另外,采用Western方法检测了表达的大熊猫IL-15蛋白的免疫原性,结果表明IL-15具有作为大熊猫疫苗佐剂的潜力;Leptin可以作为大熊猫Leptin缺乏引起的各种疾病的防治,应用于人工繁育大熊猫。4.构建了胃和脾脏的全长cDNA文库。初级文库的滴度分别为3.3×106和4.3×106;重组率分别达到85%和82%;扩增文库的滴度分别为6.9×109和6.4×109。全长文库的构建为大熊猫食性和疾病相关功能基因的挖掘和研究提供了基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 大熊猫的功能基因
• 2 Leptin基因
• 2.1 Leptin的生物学效应
• 2.2 Leptin与生殖和生长
• 2.3 Leptin在妊娠和哺乳期的作用
• 2.4 Leptin与疾病的关系
• 3 Ghrelin基因
• 4 Interleukin-15（IL-15）基因
• 第二章 大熊猫Leptin、Ghrelin和IL-15基因的克隆
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3 方法
• 3.1 总RNA的提取
• 3.2 PCR引物的设计
• 3.3 RT-PCR扩增基因
• 3.4 PCR产物回收和pMD18-T载体的连接
• 3.5 连接产物转化大肠杆菌
• 3.6 重组质粒的菌液PCR鉴定
• 3.7 重组子的序列测定
• 3.8 克隆片断的序列分析
• 3.9 克隆序列的GenBank登录
• 3.10 Ghrelin mRNA的组织分布
• 3.11 Leptin和IL-15蛋白分子结构预测
• 4 结果
• 4.1 总RNA的提取
• 4.2 Leptin、Ghrelin和IL-15的RT-PCR扩增
• 4.3 菌液PCR鉴定
• 4.4 序列测定
• 4.4.1 Ghrelin基因的序列
• 4.4.2 Leptin基因的序列
• 4.4.3 Interleukin-15基因的序列
• 4.5 序列同源性比较分析
• 4.6 Ghrelin mRNA的组织分布
• 4.7 Leptin和IL-15蛋白分子结构预测
• 5 讨论
• 第三章 大熊猫Leptin和IL-15基因的原核表达
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3 方法
• 3.1 原核表达载体的构建
• 3.2 转化BL21（DE3）及诱导表达
• 3.3 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 3.4 Western blotting
• 3.5 表达蛋白的分离纯化
• 4 结果
• 4.1 Leptin的原核表达
• 4.1.1 Leptin表达载体的构建
• 4.1.2 Leptin表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 4.1.3 Leptin蛋白的Western blotting分析
• 4.1.4 Leptin表达蛋白的分离纯化
• 4.2 IL-15的原核表达
• 4.2.1 IL-15表达载体的构建
• 4.2.2 IL-15表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 4.2.3 IL-15蛋白的Western blotting检测
• 4.2.4 IL-15表达蛋白的分离纯化
• 5 讨论
• 第四章 大熊猫生长素AmGH、Leptin和IL-15基因的真核表达
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 3 方法
• 3.1 真核表达载体的构建
• 3.1.1 引物设计
• 3.1.2 PCR反应
• 3.1.3 pPIC9质粒和扩增产物的双酶切及酶切产物连接和转化
• 3.1.4 pPIC9K表达载体的构建
• 3.2 酵母菌株GS115的分离纯化
• 3.3 酵母GS115感受态细胞的制备
• 3.4 重组质粒线性化
• 3.5 重组质粒转化感受态GS115细胞
• 3.6 含多拷贝重组质粒菌株的筛选
• 3.7 Mut+和Muts表型筛选
• 3.8 毕赤酵母基因组提取方法
• 3.9 重组酵母的PCR鉴定
• 3.10 Mut+表型重组酵母的诱导表达实验
• 3.11 Muts表型重组酵母的诱导表达实验
• 3.12 DOC-TCA浓缩沉淀表达蛋白
• 3.13 表达蛋白的SDS-PAGE电泳分析
• 3.14 GH表达蛋白的质谱鉴定和表达蛋白的Western blotting鉴定
• 3.15 蛋白质的纯化
• 3.15.1 硫酸铵分级沉淀纯化AmGH蛋白
• 3.15.2 亲和层析纯化Leptin和IL15蛋白
• 3.16 AmGH表达条件优化
• 4 结果
• 4.1 大熊猫生长素GH的真核表达
• 4.1.1 重组质粒及重组酵母鉴定
• 4.1.2 AmGH表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 4.1.3 AmGH的质谱鉴定和Western blotting检测
• 4.1.4 AmGH表达的条件优化
• 4.1.5 AmGH蛋白的纯化
• 4.2 Leptin基因的真核表达
• 4.2.1 重组质粒及重组酵母鉴定
• 4.2.2 Leptin表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 4.2.3 Western blotting
• 4.2.4 Leptin表达蛋白的纯化
• 4.3 Interleukin 15基因的真核表达
• 4.3.1 重组质粒及重组酵母鉴定
• 4.3.2 IL-15表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 4.3.3 Western blotting
• 5 讨论
• 第五章 胃和脾脏全长cDNA文库的构建
• 1 引言
• 1.1 cDNA文库构建的原理
• 1.2 均一化cDNA文库
• 1.3 差减cDNA文库
• 1.4 全长cDNA文库
• 1.5 SMART法构建全长cDNA文库
• 2 材料
• 2.1 试验材料
• 2.2 主要试剂
• 3 方法
• 3.1 总RNA提取和mRNA分离
• 3.2 单链和双链cDNA合成
• 3.3 ds cDNA的酶切和分级
• 3.4 cDNA与载体的连接和包装
• 3.5 文库滴定、重组率测定和文库的扩增
• 3.6 文库克隆测序
• 4 结果
• 4.1 总RNA提取和mRNA分离
• 4.2 双链cDNA的合成和cDNA分级
• 4.3 初级文库的滴度和重组率
• 4.4 扩增文库的滴度
• 4.5 文库克隆测序
• 5 讨论
• 第六章 本研究的主要结论和创新及后续工作
• 6.1 本文的主要结论
• 6.2 本文的创新点
• 6.3 后续工作建议
• 参考文献
• 附录
• 作者简历