1.CRH对原代培养海马神经元NMDA诱发电流的调节作用　2.CRH对原代培养海马神经元突起发育和SGK表达的调节作用

论文摘要

海马是中枢神经系统的重要脑区,机体的许多生理功能如学习和记忆等与其有着密切的关系,同时海马也是脑缺血缺氧的易损部位和众多应激激素的重要靶区。促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）是下丘脑分泌的调节HPA轴功能的多肽类激素,也是机体发生应激反应时发挥神经内分泌调节的关键激素。近年来发现,CRH不仅在HPA轴调节中起着重要作用,其作为一种重要的神经递质,在情绪反应、学习记忆和神经系统损伤与发育中也有着重要作用。目前,有关CRH对海马功能的调节及其机制尚未完全阐明。研究显示,海马神经元上可表达CRH两型受体及NMDA受体,但CRH对NMDA受体功能的调节作用尚不清晰。因此,在本课题的第一部分,我们以原代培养的大鼠海马神经元为模型,研究CRH对NMDA诱发电流(INMDA)的调节作用;分别应用CRH两型受体特异性的拮抗剂,研究CRH作用的受体机制;并给予PKA、PLC、PKC等蛋白激酶的抑制剂和激动剂,研究CRH作用的细胞内信号转导机制。在本课题的第二部分,我们着重研究了CRH对原代培养海马神经元突起发育以及与树突发育相关的动力蛋白类似蛋白MKLP1的调节作用;分别应用CRH两型受体特异性的拮抗剂或更具亲和力的激动剂,研究CRH作用的受体机制。在本课题的第三部分,我们研究了CRH对原代培养海马神经元血清和糖皮质激素调节蛋白激酶（SGK）表达的调节作用:分别应用CRH两型受体特异性的拮抗剂,研究CRH作用的受体机制;并给予PKA、PLC、PKC等蛋白激酶的抑制剂和激动剂,研究CRH作用的细胞内信号转导机制。主要实验结果如下:一、CRH对原代培养海马神经元INMDA的调节作用1.免疫荧光染色发现,CRH两型受体CRHR1和CRHR2在原代培养的大鼠海马神经元上均有表达。2.原代培养的大鼠海马神经元的静息膜电位为—56±10mv,膜电容为43.02±11.74pF。当钳制电压为-60mV时,10-4M的NMDA可在海马神经元上诱发一内向电流并迅速达峰值,很快衰减至稳定段。3.全细胞膜片钳记录结果显示,CRH作用2min可明显抑制海马神经元INMDA,呈剂量依赖关系;CRH对INMDA的抑制作用可以被CRHR1特异性的拮抗剂Antalarmin所阻断,CRHR2特异性的拮抗剂Astressin 2B对此没有明显作用,而只与CRHR2结合的UrocortinⅡ对INMDA也没有明显作用,提示CRH的这种抑制作用是由CRHR1所介导。4.cAMP放射免疫测定显示,CRH可增加海马神经元胞内cAMP水平:WesternBlot结果表明,CRH可诱导磷酸化PLC-3β表达增加;CRH的这些作用可被Antalarmin所阻断。提示CRH可通过CRHR1激活PKA和PLC通路。5.细胞外分别给予AC的抑制剂SQ22536、PKA的抑制剂H89、PLC的抑制剂U73122、IP3R的抑制剂2APB、PKC非选择性的抑制剂chelerythrine、PKCα/β亚基的抑制剂G（?）6976和PKC激动剂PMA,细胞内给予Ca2+的螯合剂BAPTA,膜片钳结果显示,CRH对INMDA的抑制作用可以被U73122、2APB、chelerythrine、G（?）6976以及BAPTA所阻断,但不能被SQ22536和H89所阻断,PMA也可剂量依赖性的抑制INMDA。以上结果提示,CRH对INMDA的抑制作用可能涉及PLC/IP3/Ca2+以及PLC/PKC通路,与AC/PKA通路无关。二、CRH对原代培养海马神经元突起发育的调节作用1.应用磷酸钙转染法将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）转入原代培养的大鼠海马神经元中,观察到CRH可增加神经元树突总长度（TDBL）;免疫荧光染色结果显示,CRH能增加微管相关蛋白2（MAP2）的表达,Antalarmin能阻断CRH的这种诱导作用,而Astressin 2B不能阻断这种作用,提示CRH通过CRHR1介导对海马神经元MAP2表达的调节作用。2.荧光实时定量PCR的结果显示,CRH可增加海马神经元MKLP1 mRNA的表达,呈剂量依赖关系:时间曲线显示,CRH在3hr内即可诱导MKLP1 mRNA的表达增加,6hr到达高峰,24hr后仍高于对照组:进一步研究还证实,CRH对MKLP1 mRNA诱导表达的作用能被CRH受体广谱的拮抗剂Astressin或CRHR1特异性的拮抗剂Antalarmin所阻断,但不能被CRHR2特异性的拮抗剂Astressin 2B阻断;而仅对CRHR2具有亲合力的UrocortinⅡ不能诱导MKLP1 mRNA的表达。以上结果说明,CRH可通过CRHR1诱导海马神经元MKLP1 mRNA的表达增加。三、CRH对原代培养海马神经元SGK表达的调节作用1.免疫荧光细胞化学和Western blot结果显示,原代培养的大鼠海马神经元上表达SGK蛋白。2.利用免疫荧光细胞化学法,检测到CRH作用3hr即可增加SGK阳性细胞率,24hr达高峰;Western blot的结果表明CRH可诱导SGK蛋白表达的增加。3.免疫荧光细胞化学和Western blot法证实CRH对SGK诱导表达的作用能被CRHR1特异性的拮抗剂Antalarmin所阻断,但不能被CRHR2特异性的拮抗剂Astressin 2B阻断,提示CRH的这种诱导表达的作用是由CRHR1所介导。4.CRH诱导SGK表达增加的作用可以被AC的抑制剂SQ22536或PKA的抑制剂H89所阻断,但不受PLC的抑制剂U73122或PKC的抑制剂G（?）6976的影响:单独运用U73122、G（?）6976或Forskolin可诱导SGK蛋白表达增加。以上结果提示,CRH对SGK蛋白表达的诱导作用涉及AC/PKA信号转导通路,与PLC/PKC通路无关,但PLC/PKC可能参与抑制了内源性SGK的表达。结论:以上结果表明:CRH与CRHR1结合后,可能通过PLC/IP3/Ca2+以及PLC/PKC通路抑制原代培养的大鼠海马神经元INMDA,而通过AC/PKA通路诱导SGK蛋白的表达。此外,CRH还可促进海马神经元树突的生长,增加MKLP1 mRNA的表达,这也是由CRHR1介导。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩写词表
• 前言
• 第一部分 CRH对原代培养海马神经元NMDA诱发电流的调节作用
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分 CRH对原代培养海马神经元突起发育的调节作用
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 第三部分 CRH对原代培养海马神经元SGK表达的调节作用
• 前言
• 材料与方法
• 实验结果
• 讨论
• 结论
• 综述
• 参考文献
• 在读期间发表论文
• 致谢