番木瓜环斑病毒CP基因IR表达载体的转化及抗病性研究

论文摘要

生产上番木瓜普遍受到病毒侵害的困扰,其中番木瓜环斑病毒造成的危害由来已久。而抗番木瓜环斑病毒的番木瓜育种工作又遇到重重障碍,这些障碍包括缺乏对PRSV具有抗性的栽培品种,PRSV株系在不同地区有差别以及存在远缘杂交不亲和现象。植物基因工程的发展为番木瓜抗PRSV提供了一条新的途径。近几年关于RNAi的研究众多,其中的一大热点就是用植物病毒本身的一段基因合成反向重复表达载体转化植物以使其获得遗传稳定的抗病性,这在很大程度上解决了运用传统方法选育抗病株系的困难。本研究以番木瓜环斑病毒的寄主植物番木瓜和黄瓜为实验材料,利用农杆菌介导法和PEG介导法将外壳蛋白CP基因反向重复表达载体导入受体材料中,并分析转入基因对植物的抗病性的影响,主要研究结果如下：（1）利用番木瓜的不同部位用不同的培养基诱导胚性愈伤组织,发现番木瓜的茎段和幼胚能在C3培养基上诱导出胚性愈伤组织,并诱导长出胚状体。后者比前者所需时间更短。本实验中还发现胚状体还能作为二次诱导胚状体的材料,且需时更少。在用农杆菌介导的方法对诱导得到的胚状体进行转化的过程中,由于农杆菌的污染问题未能有效解决,而少数未污染的胚状体在筛选培养基上逐渐褐化,未能得到转化苗。（2）先利用黄瓜“津研4号”的不同部位作为外植体,用不同的培养基进行不定芽的诱导。发现当用黄瓜的子叶节作为外植体在培养基MS+ 1.5 mg/L 6-BA+ 2.0 mg/L AgNO3上能诱导出状态良好的不定芽,不定芽在1/2MS培养基中能伸长生根。利用该黄瓜再生体系,用农杆菌介导法用不同的方法将含外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pWatergate-CP861IR, pHellsgate12-CP215IR转化受体材料,得到11株Kan抗性苗。经PCR检测,其中1株确认为pWatergate-CP861IR转化苗,3株为pHellsgate12-CP215IR转化苗,阳性率为36.4%。而且发现这4株转化苗都是在农杆菌侵染时用超声波处理了2～3s的子叶节诱导得到的,其他方法都未能得到转化苗,说明在农杆菌侵染时用超声波处理能够提高转化率。对得到的黄瓜转化苗进行炼苗处理,并移栽到蛭石中,黄瓜转化苗未能成活。（3）利用PRSV病叶提取PRSV粒子,提取得到的病毒浓度为1.0875 mg/L用番木瓜实生苗的叶片制备原生质体,并用PEG介导法将pHellsgate12-CP861IR基因和PRSV粒子共转化番木瓜原生质体。提取原生质体RNA,通过RT-PCR检测pHellsgate12-CP861IR基因对PRSV的沉默抑制效果。结果显示,该番木瓜品种为CP基因转化品种,当加入的PRSV量为0.2μg,2μg时,未能检测到PRSV的CP基因,当PRSV的量为20μg时,能检测到PRSV的CP基因。当10μg pHellsgate12-CP861IR基因和0.2μg,2μg或20μg PRSV粒子共转化原生质体时,检测不到CP基因,说明pHellsgate12-CP861IR基因的加入启动了RNAi机制,抑制了CP基因的表达。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 课题的提出
• 1.2 番木瓜环斑病毒研究进展
• 1.2.1 PRSV株系及寄主范围
• 1.2.2 PRSV的致病特征及其危害
• 1.2.3 PRSV的防治
• 1.2.4 抗PRSV番木瓜的遗传转化体系
• 1.3 外壳蛋白基因介导的抗病毒基因工程研究进展
• 1.3.1 外壳蛋白基因的作用机理
• 1.3.2 研究现状和存在的问题
• 1.3.3 番木瓜抗病毒基因工程研究进展
• 1.4 RNAi介导的抗病毒基因工程
• 1.4.1 RNAi的作用机制
• 1.4.2 RNAi的特点
• 1.4.3 RNAi介导的植物抗病毒研究进展
• 1.5 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株、质粒与毒源
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 PCR使用的引物
• 2.2 实验方法
• 861IR基因转化宿主植物番木瓜'>2.2.1 农杆菌介导的pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物番木瓜
• 2.2.1.1 番木瓜胚性愈伤的诱导
• 861IR基因转化番木瓜'>2.2.1.2 pWatergate-CP_861IR基因转化番木瓜
• 215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜'>2.2.2 pHellsgate12-CP_215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜
• 2.2.2.1 黄瓜再生体系的建立
• 215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜'>2.2.2.2 农杆菌介导的pHellsgate12-CP_215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜
• 861IR基因与PRSV病毒粒子共转化原生质体'>2.2.3 pHellsgate12-CP_861IR基因与PRSV病毒粒子共转化原生质体
• 2.2.3.1 PRSV病毒粒子的提取
• 2.2.3.2 番木瓜原生质体的制备
• 861IR基因与PRSV病毒粒子共转化番木瓜原生质体'>2.2.3.3 pHellsgate12-CP_861IR基因与PRSV病毒粒子共转化番木瓜原生质体
• 861IR基因对PRSV外壳蛋白表达的影响分析'>2.2.3.4 pHellsgate12-CP_861IR基因对PRSV外壳蛋白表达的影响分析
• 3 结果与分析
• 861IR基因转化宿主植物番木瓜'>3.1 农杆菌介导的pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物番木瓜
• 3.1.1 番木瓜胚性愈伤的诱导
• 861IR基因转化番木瓜'>3.1.2 pWatergate-CP_861IR基因转化番木瓜
• 215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜'>3.2 pHellsgate12-CP_215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜
• 3.2.1 黄瓜再生体系的建立
• 3.2.1.1 外植体的选择
• 3.2.1.2 诱芽培养基的选择
• 3.2.1.3 伸长生根培养
• 215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜'>3.2.2 农杆菌介导的pHellsgate12-CP_215IR和pWatergate-CP_861IR基因转化宿主植物黄瓜
• 3.2.2.1 筛选压的确定
• 3.2.2.2 农杆菌对外植体的侵染及共培养
• 3.2.2.3 抗性筛选培养
• 3.2.2.4 抗性植株的PCR检测及炼苗
• 861IR基因与PRSV病毒粒子共转化原生质体'>3.3 pHellsgate12-CP_861IR基因与PRSV病毒粒子共转化原生质体
• 3.3.1 PRSV病毒粒子的提取
• 3.3.2 番木瓜原生质体的制备
• 861IR基因与PRSV病毒粒子共转化原生质体'>3.3.3 pHellsgate12-CP_861IR基因与PRSV病毒粒子共转化原生质体
• 4 讨论
• 4.1 农杆菌介导的番木瓜遗传转化
• 4.2 农杆菌介导的黄瓜遗传转化
• 861IR基因与PRSV粒子共转化原生质体'>4.3 pHellsgate12-CP_861IR基因与PRSV粒子共转化原生质体
• 4.4 下一步工作及展望
• 参考文献
• 附录1 图版与说明
• 附录2 常用试剂的配制
• 致谢