木素过氧化物酶光度法检测环境污染物

论文摘要

随着社会经济的迅速发展和人口的急剧增多，人类活动（包括生产活动和生活活动）向环境中排放的各种污染物日益增多。在这众多的污染物中，芳香化合物（尤其是芳香胺、酚类物质）和有机过氧化物的污染越来越引起人们的关注。芳香胺主要来自染料、聚合体、除草剂、杀虫剂等在环境中的降解。酚类主要是来自石油化工、树脂、塑料、医药品、聚合体、杀虫剂、抗氧化剂等工业排出的废水中。大气中的过氧化物主要来源于光化学烟雾的二次污染物，而油脂自动氧化也能产生氢过氧化物。这些有害化学品对人体健康和环境的危害是环境保护中亟待解决的重要问题，必须引起全社会高度重视，因此很有必要建立简单可行的芳香化合物和有机过氧化物的测检方法。木素过氧化物酶（LiP）是20世纪80年代初发现的真菌过氧化物酶。它与其它过氧化物酶的结构和催化反应机制相似，但其氧化还原电位更高（1．36 V vs．NHE），许多酚型和非酚型有机化合物都可作为LiP的反应底物，其中藜芦醇（VA）是最适底物。然而它在分析检测方面的应用报道还非常少。以往的过氧化物酶法检测多是人工一次性加入H2O2来引发反应，并且都集中在传统的水介质中。这就出现了数据重现性差、方法选择性差、以及疏水性化合物难以检测等问题。为了克服以上缺点，本文利用葡萄糖氧化酶（GOD）氧化葡萄糖产生H2O2，H2O2缓释明显改善了LiP的催化活性，从而使初速率增大，准确性大幅度提高；利用LiP酶促双底物氧化机制，通过选取适当的指示底物，提高酚类物质测定选择性；利用LiP酶的过氧化物依赖性，借助胶束酶学研究方法，在反胶束中建立了疏水性有机过氧化物的LiP酶法检测。以上三种措施可以克服现有过氧化物酶法检测的缺点，也是本论文的主要创新之处。论文分四章：第一章介绍了芳香胺、酚类、有机过氧化物的污染现状及常规分析检测方法，重点突出了酶法分析。此外，就本课程采用的LiP酶也做了一些背景介绍，简单论述了反胶束介质中LiP酶的催化性能与反应动力学。共引用了122篇文献。在论文的第二章中，研究了水介质中GOD和LiP偶联分光光度法测定芳香胺的分析特性。利用GOD和葡萄糖反应产生的H2O2来引发LiP的反应，以防止H2O2的浓度过高对LiP活力产生抑制的负面影响。从葡萄糖浓度、pH值、GOD的量等几方面讨论了反应条件对灵敏度的影响，确定了最佳的实验条件和分析方法的分析特性，并用加标法测定了胡萝卜中的芳香胺。单酶体系和双酶偶联体系比较表明：酶法产生H2O2要比人工外部一次性加入好，记录的动力学曲线线性范围宽，初始速率大，提高了检测的灵敏度，又利于准确定量测定。在本论文的第三章，尝试根据酚类物质对LiP催化氧化芳香胺的动力学曲线的影响，建立酚类物质选择性酶法测定方法。酚对LiP催化氧化芳香胺的影响与酚和指示底物氧化还原电位的相对高低有关。当选用3,3’-二甲基联苯胺（OTD）做指示底物时，发现氧化还原电位高于OTD的酚可以与OTD同时被氧化，而氧化还原电位低于OTD的酚则比OTD更易被氧化，致使延迟一段时间之后才能在A-t曲线上观察到指示反应的进行。寻找最佳实验条件，通过记录指示反应的初速率降低值或抑制时间可以选择性测定酚类物质。在以对甲氧基苯胺（PAD）做指示底物时，能观察到氧化还原电位高于PAD的酚增大指示反应的反应速率，氧化还原电位低于PAD的酚降低指示反应的反应速率，但通过记录指示反应的初速率降低值或升高值不能选择性测定酚类物质。本文通过H2O2的缓释，可以提高测定结果灵敏度和工作曲线的线性范围。本论文的第四章建立了AOT／Brij30反胶束介质中有机过氧化物的酶法光度检测方法。方法思路是LiP催化氧化邻苯二胺，其反应的初速率与样品中有机过氧化物的浓度成一定的比例关系。由于有机过氧化物的水不溶性，所以选择一个既能增溶有机过氧化物又能使LiP保持高活力的介质是首先需要解决的问题。本文通过一定比例的AOT与Brij30复配，形成一种新的反胶束体系，即提高疏水性化合物的溶解度又能使LiP保持很高的催化活力。研究了反胶束大小(（ω0）、pH等介质对检测灵敏度的影响，确定了最佳的实验条件和分析方法的分析特性，并用加标法测定橄榄油中的有机过氧化物。橄榄油先用盐酸水解，除去水溶性干扰物质，油相用乙酸乙酯萃取，萃取液直接加到反应体系中进行检测。与现有方法相比，步骤少，避免了样品制备过程中的污染和损失。是一种简单可靠的方法，其检测限和灵敏度满足橄榄油中过氧化物的检测要求。

论文目录

• 符号与缩写
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1 文献综述
• 1.1 芳香胺化合物的污染现状及分析方法
• 1.2 酚类化合物的污染现状及分析方法
• 1.3 有机过氧化物的污染现状及分析方法
• 2 酶法分析
• 2.1 酶的基本特性
• 2.2 酶法分析方法
• 2.3 酶法分析的应用
• 3 木素过氧化物酶简介
• 3.1 LiP的结构
• 3.2 LiP催化氧化有机物（AH）的机理
• 3.3 过氧化物在LiP催化氧化反应中的作用
• 3.4 LiP的研究现状
• 4 反胶束与LIP
• 4.1 反胶束的形成与性质
• 4.2 胶束酶学简介
• 4.3 LiP在反胶束中的动力学及催化性能研究
• 5 本论文所谓研究内容
• 第二章 木素过氧化物酶-葡萄糖氧化酶偶联氧化芳香胺的分析特性
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 溶液的配制
• 2.3 LiP的培养、纯化及活力的标定
• 2.4 实验过程
• 2.5 GOD活力标定
• 2.6 样品的处理
• 3 结果和讨论
• 3.1 单酶体系条件的优化
• 3.2 GOD-LiP偶联体系条件的优化
• 3.3 单酶体系和双酶偶联体系酶活力比较
• 3.4 反应体系全波长扫描图
• 3.5 分析特性
• 3.6 胡萝卜中共存物质的影响
• 3.7 胡萝卜中芳香胺的测定
• 4 结论
• 第三章 木素过氧化物酶催化氧化芳香胺做指示反应选择性测定酚类物质
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 溶液的配制
• 2.3 LiP、GOD活力标定
• 2.4 实验方法
• 2.5 氧化还原电位测定
• 3 结果和讨论
• 3.1 化合物的氧化还原电位
• 3.2 OTD做指示底物
• 3.3 PAD做指示剂
• 4 结论
• 第四章 反胶束介质中以木素过氧化物酶催化氧化邻苯二胺为指示反应测定有机过氧化物
• 1 前言
• 2 实验部分
• 2.1 仪器与试剂
• 2.2 溶液的配制
• 2.3 LiP的培养、纯化、活力标定
• 2.4 实验方法
• 2.5 样品的处理
• 3 结果和讨论
• 3.1 LiP在AOT/Brij30反胶束中呈现高活力的介质条件
• 3.2 LiP催化氧化的OPD机理
• 3.3 分析特性
• 3.4 共存物质的影响
• 3.5 橄榄油中有机过氧化物的测定
• 4 结论
• 参考文献
• 致谢
• 学位论文评阅及答辩情况表