论文摘要
目的:HCCR是Ko等人用差异显示RT-PCR方法从人子宫颈癌组织筛选并鉴别出来的一种与人类多种肿瘤有关的癌基因。HCCR分为HCCR-1、HCCR-2两个亚型。HCCR在肝癌组织细胞呈强阳性,在肝硬化组织细胞中呈弱阳性,而在正常肝组织细胞中则为阴性。HCCR-2可作为抑癌基因P53的负向调控因子,引起肿瘤的发生。我们通过反义核酸及RNA干涉技术,抑制人肝癌细胞HepG2中HCCR-2（human cervical cancer oncogene 2 ）的表达,观察细胞生物学行为变化,检测Bax、Bcl-2蛋白表达的变化和突变型p53基因mRNA表达的改变,初步探讨HCCR-2在人肝癌细胞中的作用,为肝癌基因治疗提供新的思路。方法:1、利用降落RT-PCR从肝癌细胞HepG2中克隆并构建其正反义真核表达载体;根据RNA干涉序列的设计原则,在线设计3条针对HCCR-2编码区的干涉序列,构建HCCR-2的RNA干涉真核表达载体以及阴性对照载体。2、将反义真核表达载体及干涉载体利用脂质体转染HepG2细胞,经G418抗性筛选获得稳定表达的细胞株。3、半定量RT-PCR、real-time PCR检测肝癌细胞HepG2转染前后HCCR-2 mRNA表达变化。4、细胞形态特征的变化:通过HE染色、透射电镜、激光共聚焦等观察细胞形态学改变。5、通过MTT、平板克隆形成实验及细胞迁移实验,观察细胞的增殖、存活和迁移能力。6、通过流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的改变。7、通过半定量RT-PCR检测突变型p53基因表达水平的改变。8、western blot检测Bax、Bcl-2的变化。结果:1、成功从HepG2克隆出HCCR-2目的片段,反义真核表达载体和干涉真核表达载体经测序证实完全正确,说明载体构建成功。2、经过G418筛选和克隆挑选,获得稳定转染的细胞株,转染细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。3、半定量RT-PCR揭示:反义组细胞HCCR-2 mRNA表达水平下调;3个干涉载体中的2个能有效抑制HCCR-2 mRNA的表达。4、与亲本细胞和对照组细胞相比,反义组、干涉组细胞生物学特性发生如下变化:（1）细胞形态:细胞呈梭形,核浆比例有所下降,透射电镜下可观察到细胞核收缩变圆,胞质浓缩,细胞核中染色质边集、皱缩,密度增高。（2）细胞生长减慢。（3）克隆形成能力下降。其中亲本细胞克隆数为:129.3±13.57,对照细胞为:120.3±9.86个,反义组为: 63.66±9.50 ,干涉组分别为: 63±14.52（HepG2/H1）、29.6±3.21（HepG2/H3）个。反义组、干涉组细胞克隆数明显少于亲本和阴性对照组细胞,P<0.05,亲本细胞和对照组之间无明显差异。（4）细胞迁移能力下降。其中亲本组细胞迁移数为:86±4.58个,对照组细胞为:81.33±7.37个,反义组细胞为:55.33±3.05个,干涉组细胞分别为:52.6±4.16（HepG2/H1）、44.6±2.51（HepG2/H3）个。5、（1）细胞凋亡率增加。反义组、干涉组细胞细胞凋亡率增加,明显高于亲本细胞和对照组细胞（P<0.05）。（2）反义组、干涉组细胞G0/G1期细胞增加,S期细胞下降。6、经RT-PCR半定量检测,反义组、干涉组细胞p53 mRNA表达与亲本及对照组细胞相比无显著变化。7、western blot结果提示反义组、干涉组Bax表达增加,Bcl-2表达下降。结论:1、成功构建HCCR-2反义和干涉真核表达载体,并获得它们稳定转染HepG2的细胞株。2、筛选出2条特异性针对HCCR-2的干涉序列。3、HepG2细胞经HCCR-2反义核酸和RNA干涉抑制后,细胞增殖减慢、克隆形成及细胞迁移能力下降。4、HCCR-2参与肝癌HepG2细胞周期的调控,并与细胞的生长增殖及凋亡有关。5、HCCR-2表达水平的改变不能影响突变型p53的mRNA表达。6、Bax、Bcl-2参与了HCCR-2反义核酸及干涉所诱导的HepG2细胞的凋亡。
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