抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因扩增和序列分析

论文摘要

猪囊尾蚴病是由猪带绦虫的幼虫（囊尾蚴）引起的一种人畜共患病。我国人体囊尾蚴病分布广泛,严重威胁着广大人民健康。多年来防治本病主要是以药物防治为主,但是由于抗药性的不断出现及药物残留等问题的严重性,限制了其在临床上的应用。进入20世纪80年代后,分子生物学技术的快速发展促进了抗体研究的进展,基因工程抗体应运而生。其中单链抗体是目前应用最为广泛的重组抗体,在各个领域均有大量研究报道。但在寄生虫研究中尤其是猪囊尾蚴领域没有单链抗体的报道。本实验克隆出抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因片段,为抗猪囊尾蚴单链抗体的构建奠定了基础。方法:首先,复苏分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞,培养至最佳生长状态,琼脂糖扩散试验检测分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞的活性。取活性高的杂交瘤细胞,用Trizol一步法提取分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA。然后,根据genebank公布的相关序列,合成两对特异性引物,以提取的总RNA为模板,经一步法RT-PCR反应扩增抗体轻重链可变区基因。最后,将扩增抗体轻重链可变区基因与克隆载体pMD18-T连接,琼脂糖电泳检测后,转化于感受态细胞JM109。蓝白斑法筛选出阳性重组子进行菌落PCR鉴定。取含有阳性重组子的菌液送至生物公司测序。结果:提取分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体的杂交瘤细胞总RNA后,应用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测提取得总RNA。结果显示:A260/280值=1.96;RNA琼脂糖凝胶电泳可以清晰地看到28sRNA,18sRNA的条带。证明得到了能够分泌抗猪囊尾蚴特异性单克隆抗体杂交瘤细胞总RNA。以提取的总RNA为模板,一步法RT-PCR反应扩增抗体轻重链可变区基因。经琼脂糖凝胶电泳检测,轻链可变区基因和重链可变区基因长度在400bp左右,符合鼠抗体特征,表明得到了抗猪囊尾蚴单克隆抗体轻重链可变区基因片段。经琼脂糖凝胶电泳检测回收后连接克隆载体pMD18-T,转化感受态细胞JM109,蓝白斑法筛选出阳性重组子,以通用引物对阳性重组子进行鉴定,菌落-PCR检测证明重组子为阳性。测序结果显示:重链可变区基因全长为357bp,编码119个氨基酸;轻链可变区基因全长315bp,编码105个氨基酸。同源性比较结果显示:重链的同源性为94%,轻链的同源性为96%,符合鼠抗体轻链可变区和重链可变区基因特征。抗原表位互补结合的互补决定区（CDR）基因有多数发生改变,且在重链可变区基因的CDR2中有基因缺失现象,轻链可变区基因的CDR3中有基因缺失现象。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 猪囊尾蚴病简介
• 1 猪囊尾蚴流行病学
• 1.1 流行新特点
• 1.2 流行原因
• 1.3 感染与危害
• 第二章 猪囊尾蚴病病原入侵与免疫机制研究进展
• 1 病原入侵致病作用及免疫逃避机制
• 1.1 病源入侵与之致病机制
• 1.2 病原感染时的机体免疫反应
• 1.3 囊尾蚴免疫抑制的研究进展
• 第三章 囊虫病防治研究进展
• 1 国内外疫苗研究进展
• 1.1 蛋白质疫苗
• 1.2 核酸疫苗
• 2 抗体研究进展
• 2.1 单克隆抗体的研究进展
• 2.2 单链抗体的研究进展
• 第四章 实验内容
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 RNA紫外分光光度计检测
• 2.2 电泳检测结果
• 2.3 轻重链可变区基因的PCR扩增及鉴定
• 2.4 轻重链可变区基因片段回收产物检测
• 2.5 轻链可变区基因的重组质粒PCR鉴定
• 2.6 重链可变区基因的重组质粒PCR鉴定
• 2.7 轻重链可变区基因测序结果及其分析
• 3 讨论
• 3.1 单链抗体的构建
• 3.2 RNA的分离
• 3.3 RT-PCR反应
• 3.4 重组质粒转化感受态细胞
• 3.5 阳性重组质粒鉴定
• 3.6 测序
• 3.7 轻重链可变区序列分析
• 4 结论
• 参考文献
• 附录Ⅰ
• 致谢
• 个人简介