猪白血病抑制因子（LIF）的分子生物学研究 ——猪LIF的cDNA克隆，原核、真核表达，特性，免疫定位

论文摘要

LIF（白血病抑制因子）是一种多功能的细胞因子,属于白介素-6（IL-6）家族中成员,与IL-11﹑OSM（onconstatin-M）﹑CNTF（ciliary neurotrophic factor）和CT-1（cardiotrophin）共享gp130受体亚基。LIF的天然形式是38-67kDa的糖基化蛋白,在哺乳动物的成年个体和胚胎中广泛表达。体内外研究表明, LIF具有多种生物功能,包括诱导骨髓白细胞分化,促进原始生殖细胞的增殖,维持胚胎干细胞的多潜能性,促进子宫内膜蜕膜化及胚泡着床﹑海马-垂体-肾上腺素轴的活化及垂体发育等。LIF在体外能够抑制小鼠胚胎干细胞的分化,维持干细胞处于多潜能状态。这种能力导致一种新的生物技术——基因打靶的诞生,从而使得人们在胚胎干细胞水平上进行基因的改造和敲出成为可能,并且通过胚胎操作可获得能稳定遗传的突变小鼠个体,从而能够在动物体内进行基因功能的研究。然而这种操作除了小鼠之外,其他动物至今没有获得将新的遗传性状转进生殖系的嵌合个体。究其原因有多种,其中之一可能是采用小鼠LIF和鼠源的滋养层细胞来培养胚胎干细胞。尽管LIF蛋白及其基因在哺乳动物之间是高度保守的,其对不同种系胚胎干细胞的作用仍可能存在差别。猪的许多器官在形态和生理方面与人相似,因此是研究人体生理和人类疾病比较理想的模式动物。然而,稳定的多潜能猪胚胎干细胞系至今没有培养成功。没有使用猪LIF可能是其中的原因之一。因此我们推测猪LIF在培养猪ES或EG细胞方面可能比其它物种的LIF更有效,值得探索应用重组猪LIF协助培养稳定的多潜能猪胚胎干细胞。但是,编码猪LIF的cDNA基因序列还没有克隆。本文的研究目的是克隆和表达猪LIFcDNA基因,获得有活性的重组猪LIF蛋白,为进一步培养猪胚胎干细胞做好准备。在本研究中,我们采用分子生物学技术和基因工程技术克隆了猪LIF的cDNA序列,并进行了原核﹑真核表达以及功能研究。首先,采用异硫氰酸胍法从仔猪脾脏中提取总RNA,然后提取mRNA并进行RT-PCR扩增,得到606bp编码全长猪LIF蛋白（202个氨基酸）和567bp编码成熟猪LIF蛋白（189个氨基酸）的cDNA序列。通过序列比对,猪全长LIF蛋白与人LIF有86%的同源性,而与小鼠LIF有84%的同源性,三者之间6个N-连接糖基化位点和6个能形成二硫键的半胱氨酸完全保守。获得的606bp全长猪LIF编码序列（pLIF）亚克隆进真核表达载体pcDNA3.1-myc-HisA,使表达的pLIF蛋白C-末端带有c-myc和6 His标签,可用c-myc或6 His标签抗体对重组蛋白进行检测;将567bp的成熟猪LIF编码序列（pmLIF）克隆进原核表达载体pET31b中,构建了表达质粒pcDNA3.1-pLIF-MycHis和pET31b-pmLIF。同时以pcDNA3.1-pLIF-MycHis为模板扩增出带c-myc和His6编码序列的基因片断,构建出另外一个原核表达质粒pET31b-pmLIF-MycHis。将质粒pET31b-pmLIF和pET31b-pmLIF-MycHis转化进宿主菌

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引 言
• 一、白血病抑制因子（LIF）的基因结构与调控
• （一） LIF 的基因及其一级结构
• （二） LIF 基因表达
• （三） LIF 蛋白的三级结构
• 二、 白血病抑制因子受体（LIFR）的基因及调控
• （一） LIFR 受体基因及结构
• （二） 膜结合形式的 LIFR
• （三） 可溶形式 LIFR
• （四） gp130 基因及其产物
• （五） LIFR-gp130 受体亚基复合体
• 三、LIF 的信号途径
• （一） Jak-STAT 途径
• （二） 胞质受体结构域
• （三） Jak-STAT 信号的负反馈调节因子
• （四） 有丝分裂原激活激活蛋白激酶途径
• 四、 白血病抑制因子（LIF）的功能
• （一） LIF 是造血和神经生发因子
• （二） LIF 与生殖及内分泌系统的关系
• （三） LIF 对胚胎干细胞的作用
• （四） LIF 在炎症中的作用
• （五） LIF 对骨代谢的作用
• （六） LIF 对能量代谢的作用
• （七） LIF 对肿瘤的内分泌应答作用
• 五、猪 LIF 及猪胚干细胞（ES 和 EG）的国内外研究进展
• 六、本文的选题依据及研究目的和意义
• 第一章 材料与方法
• 一、 实验材料
• （一） 实验动物
• （二） 实验仪器
• （三） 主要试剂
• 二、实验方法
• （一） 猪脾总 RNA 的提取
• （二） 质粒构建
• （三） 重组pLIF 蛋白的原核表达
• （四） 重组蛋白的纯化和复性
• （五） 重组pLIF 蛋白的真核表达
• （六） Western Blotting
• （七） 重组pLIF 蛋白的活性鉴定
• （八） 猪 LIF 多克隆抗体的制备
• （九） LIF 蛋白在猪体内的免疫定位
• 第二章 结果与分析
• 一、猪 LIFcDNA 的克隆
• （一） 猪脾脏总 RNA 的提取
• （二） RT-PCR
• （三） 表达质粒的构建
• （四） 质粒测序
• （五） 猪﹑人和小鼠LIF 蛋白氨基酸序列比较
• 二、重组猪 LIF 蛋白的表达
• （一） 重组猪 LIF 蛋白在大肠杆菌中的表达﹑纯化和复性
• （二） 重组猪 LIF 蛋白在 CHO 细胞中的表达
• 三、重组猪LIF 蛋白的活性鉴定
• 四、LIF 蛋白在猪体内的免疫定位
• 第三章 讨论
• 一、猪LIFcDNA的克隆
• 二、重组猪 LIF 蛋白的表达
• 三、重组猪 LIF 蛋白的活性分析
• 四、 猪LIF蛋白多克隆抗体的制备与免疫定位
• 五、 克隆﹑表达重组猪 LIF 蛋白的意义
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间已发表的论文