荷包红鲤胰蛋白酶的分离纯化及胰蛋白酶的固定化

论文摘要

胰蛋白酶（EC 3.4.21.4）属丝氨酸蛋白酶家族,有肽链内切酶活性,具有高度的专一性,在鱼类食物蛋白质的消化中起重要的生理作用。荷包红鲤（Cyprinus carpio var.wuyuanensis）是江西一大特色鱼种,隶属于鲤形目、鲤科、鲤属,被全国水产原种和良种审定委员会审定为适宜推广的水产养殖品种。目前对荷包红鲤的消化生理研究较少,有关其胰蛋白酶分离纯化及其性质的研究至今尚未见到报道。本论文主要从这两方面开展研究,并初步探讨了胰蛋白酶的固定化处理方法及应用,以期能为鱼类基础营养研究和饲料开发提供理论依据,使胰蛋白酶的利用达到更高一个层次。1、荷包红鲤胰蛋白酶的分离纯化主要有四个步骤：粗酶液提取、硫酸铵分级沉淀、亲和层析、SDS-PAGE分子量测定。结果显示,含25mM钙离子的粗酶提取液,激活20小时效果最佳；用30%-70%硫酸铵分级饱和度可收集得到大部分胰蛋白酶。亲和层析阶梯洗脱法在pH3时收集得到蛋白峰,经检测具有胰蛋白酶活性。经SDS-PAGE凝胶电泳分离后仅显示一个条带,推算其分子量为26.5kD。最终荷包红鲤胰蛋白酶的纯化倍数达到151.4倍,酶比活力为84.81U/mg,产率17.4%。2、荷包红鲤胰蛋白酶的部分性质：pH、温度、米氏常数Km胰蛋白酶比活力在pH=7.5时达到最大值,pH 6-7.5之间呈上升趋势,而在PH 7.5-10之间呈缓慢降低趋势。温度适应能力在4-40℃之间,酶比活力呈上升状态,在40℃时酶比活力达到最大值,在60℃时酶比活力明显减小。胰蛋白酶催化水解BAPNA的动力学过程,得到的Km值为0.056 mol·L-1。3、胰蛋白酶的固定化壳聚糖为载体,以共价偶联的方法,探讨了壳聚糖颗粒制备过程及固定后胰蛋白酶的部分性质变化。结果表明：2.5%壳聚糖胶体在碱溶液内凝结成的细小颗粒经0.5%的戊二醛交联后固定效果最佳,即为结构化壳聚糖颗粒。每克壳聚糖颗粒用6mg未固定的游离胰蛋白酶固定,达到最佳固定效果,酶比活力101U/g,回收率42.6%。壳聚糖-固定化胰蛋白酶的性质：固定化酶的最适pH为8,但其耐碱性明显变宽,pH为10时其活力仍有最大活力的87.7%。固定化酶在40～60℃范围内活性最高,80℃时仍具有最高活力的60%。固定化酶的Km值比未固定游离态酶的高出约一倍,但经五轮重复实验后,固定化酶仍具有30%的酶活力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部 荷包红鲤胰蛋白酶的分离纯化及部分性质测定
• 第一章 文献综述
• 1 荷包红鲤
• 1.1 简介
• 1.2 荷包红鲤研究现状
• 2 鱼类消化酶
• 2.1 概述
• 2.2 消化酶的研究现状
• 3 胰蛋白酶的研究状况
• 3.1 胰蛋白酶
• 3.2 胰蛋白酶的激活
• 3.3 胰蛋白酶的性质
• 3.3.1 pH和温度对胰蛋白酶活性的影响
• 3.3.2 鱼类食性对胰蛋白酶活性的影响
• 3.3.3 金属离子和抑制剂对胰蛋白酶活性影响
• 4 胰蛋白酶的分离纯化
• 4.1 胰蛋白酶分离纯化的研究进展
• 4.2 胰蛋白酶分离纯化的方法
• 4.2.1 前处理
• 4.2.2 粗分级分离
• 4.2.3 细分级分离
• 4.3 胰蛋白酶的分子量
• 5 鱼类胰蛋白酶的研究意义
• 本文研究内容
• 第二章 材料和方法
• 2.1 常用实验材料
• 2.1.1 实验鱼
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 常规实验方法
• 2.2.1 胰蛋白酶粗酶液的提取
• 2.2.2 胰蛋白酶活性测定
• 2.2.3 蛋白质含量的测定
• 2.2.4 考马斯亮蓝染色法制备蛋白质标准曲线
• 2.2.5 样品蛋白质含量的测定
• 第三章 荷包红鲤胰蛋白酶粗酶液提取条件的探究
• 3.1 实验试剂配制
• 3.2 实验方案
• 3.3 实验方法
• 3.4 实验过程
• 3.5 实验结果
• 3.5.1 胰蛋白酶活力测定的不同底物法
• 3.5.2 胰蛋白酶激活的最适钙离子浓度及激活时间
• 3.6 讨论
• 3.6.1 胰蛋白酶活力测定中底物的选择
• 3.6.2 胰蛋白酶的最适激活条件
• 第四章 荷包红鲤胰蛋白酶的分离纯化
• 4.1 实验方案
• 4.2 实验过程
• 4.2.1 荷包红鲤胰蛋白酶的提取
• 4.2.2 硫酸铵分级沉淀
• 4.2.2.1 最佳盐析条件的确定
• 4.3 透析
• 4.3.1 透析袋预处理
• 4.3.2 透析袋的重复利用
• 4.3.3 荷包红鲤胰蛋白酶粗酶液透析
• 4.4 亲和层析
• 4.4.1 上样
• 4.4.2 洗脱
• 4.4.3 清洗和再生
• 4.4.4 亲和层析后样品和柱子的保存
• 4.5 胰蛋白酶分子量的测定
• 4.5.1 主要试剂
• 4.5.2 电泳操作步骤
• 4.5.3 电泳迁移率的计算和标准曲线的制作
• 4.6 结果与分析
• 4.6.1 荷包红鲤胰蛋白酶最佳盐析条件的确定
• 4.6.2 荷包红鲤胰蛋白酶亲和层析图谱
• 4.6.3 荷包红鲤胰蛋白酶分子量
• 4.6.4 荷包红鲤胰蛋白酶分离纯化的结果
• 4.7 讨论
• 4.7.1 硫酸铵分级沉淀
• 4.7.2 亲和层析
• 4.7.3 SDS-PAGE凝胶电泳
• 第五章 荷包红鲤胰蛋白酶部分性质的研究
• 5.1
• 5.1.1 胰蛋白酶催化BAPNA水解反应的动力学（Km）
• 5.1.2 pH对胰蛋白酶反应速率的影响
• 5.1.3 温度对胰蛋白酶反应速率的影响
• 5.2 结果分析
• 5.2.1 荷包红鲤胰蛋白酶的动力学常数Km
• 5.2.2 荷包红鲤胰蛋白酶的最适pH
• 5.2.3 荷包红鲤胰蛋白酶的最适温度
• 5.3 讨论
• 5.3.1 荷包红鲤胰蛋白酶的动力学常数Km
• 5.3.2 pH对荷包红鲤胰蛋白酶活性的影响
• 5.3.3 温度对荷包红鲤胰蛋白酶活性的影响
• 第二部 胰蛋白酶的固定化
• 第一章 前言
• 1.1 固定化技术
• 1.2 固定化过程
• 1.3 固定化材料
• 1.4 固定化酶
• 1.5 固定化酶的要求
• 1.6 固定化对酶性质的影响
• 1.7 本文研究内容
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 实验试剂和仪器
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 固定化胰蛋白酶活力的测定
• 2.2.2 壳聚糖微粒的制备条件初探
• 2.2.3 选择适宜的胰蛋白酶浓度做固定化
• 2.2.4 固定化胰蛋白酶的制备
• 2.2.5 固定化胰蛋白酶的性质检测
• 2.2.5.1 固定化胰蛋白酶的最适pH值测定
• 2.2.5.2 固定化胰蛋白酶的最适温度值测定
• 2.2.6 固定化胰蛋白酶的重复使用
• 2.2.7 固定化胰蛋白酶的Km值
• 第三章 实验结果和讨论
• 3.1 壳聚糖微粒
• 3.2 固定化胰蛋白酶的最适浓度
• 3.3 固定化胰蛋白酶的最适pH
• 3.4 固定化胰蛋白酶的最适温度
• 3.5 固定化胰蛋白酶的重复反应能力
• 3.6 固定化处理对胰蛋白酶Km值的影响
• 小结
• 致谢
• 参考文献