论文摘要
研究背景：淋巴瘤是源于淋巴造血系统的恶性肿瘤,包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤两大类,其中经典型霍奇金淋巴瘤（Classical Hodgkin lymphoma,cHL）有着独特的病理学特征：极少数的（<1%）肿瘤性霍奇金／里-斯（Hodgkin/Reed-sternberg, H/RS）细胞浸润在大量的非肿瘤性炎性背景细胞中。以T细胞为主、多种细胞参与（B细胞、浆细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞等）构成了cHL的特殊微环境。因此,研究cHL不仅要关注肿瘤细胞本身,同时要重视微环境在肿瘤发生、发展过程中的作用。H/RS细胞可能通过多种细胞因子参与了体内的生存、增殖和逃避凋亡的过程。WRS细胞周围的背景炎细胞大部分为T淋巴细胞,令人惊奇的是,肿瘤细胞并没有被T细胞杀伤,相反得到了存活,据此推测T淋巴细胞在维持WRS细胞存活中起着至关重要的作用。肿瘤细胞同包括T细胞在内的免疫细胞之间通过细胞因子／趋化因子相互作用得以生存,以此营造了H/RS细胞适宜的生存环境。为探讨相关的细胞因子／趋化因子在其中的作用,本课题组前期利用GeneSifter在线软件和BRB-ArrayTools,对公共基因芯片数据库GEO （Gene Expression Omnibus）中的cHL细胞株（L428）与Burkitt淋巴瘤细胞株（Raji）、HL病变组织分离的H/RS细胞与弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）病人瘤组织的基因芯片表达数据分别进行统计学分析,发现在cHL高表达的趋化因子包括RANTES/CCL5、CCL17、CCL22、SISd、IL-6和CXCL16,其中CXCL16引起了我们的关注。趋化因子CXCL16是由防御性免疫细胞产生的唯一一种以两种形式(跨膜型（TM-CXCL16）和可溶性（SCXCL16）存在的CXC趋化因子,主要表达于Thl细胞、NK细胞和激活的CD8+T细胞,在效应T细胞的迁移、APC和CD8+T细胞的相互作用、细胞免疫应答和炎症反应以及胸腺细胞的发育中发挥作用。研究发现CXCL16在动脉粥样硬化、风湿免疫、炎症及HIV感染等多种疾病中对白细胞迁移起着重要作用。由于肿瘤细胞游走与白细胞迁移有许多相似性,趋化因子家族在肿瘤器官选择性转移及癌症进展中起关键作用,CXCL16对肿瘤的影响近来受到国内外密切关注,成为当前研究的热点。国外研究较多的是前列腺癌、乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等腺癌细胞及人神经胶质瘤细胞CXCL16的表达。CXCL16可以存在于肿瘤细胞,为肿瘤细胞生长、黏附及定向迁移提供了条件,与肿瘤侵袭、转移相关；也可以存在于浸润的免疫细胞上,参与肿瘤细胞与机体免疫系统的相互作用,但是与肿瘤发生发展的关系尚未完全阐明。2009年Darash-Yahana在28例淋巴瘤组织中检测发现25%的病例有CXCL16的高表达,但是淋巴瘤类型众多、组织学形态各异,究竟在哪一类淋巴瘤中表达尚未知晓。而Hitoshi在对多株H/RS细胞株进行细胞因子/趋化因子表达检测时发现HL细胞表达CXCL16及其受体,但是在H/RS细胞株的表达与其他不同来源的细胞株中表达是否存在差异有待探讨。国外和我们前期的研究证实了H/RS细胞表型的形成与CD99基因低表达和NF-κB信号通路持续活化相关,我们还发现调控CD99的表达影响了多种细胞因子和趋化因子的表达,但是是否影响CXCL16的表达、NF-κB信号通路的改变与之有何关系等一系列问题亦有待探讨。国外和我们前期的实验表明eHL微环境细胞中最显著的是CD4+T细胞。如果CXCL16在H/RS细胞表达,是通过针对肿瘤细胞本身的直接效应还是通过对周围CD4+T细胞的间接效应影响H/RS细胞的生存等问题亦值得探究。为此,本研究目标如下：研究目标：（1）明确CXCL16及其受体CXCR6在淋巴瘤细胞体外表达特征,分析不同来源的细胞株与H/RS细胞株CXCL16表达的差异；（2）观察CXCL16与CD99表达的相关性及NF-κB信号通路对其影响,分析CD99、CXCL16与NF-κB信号通路之间的可能关系；（3）检测CXCL16对cHL细胞株L428及外周血CD4+T细胞的增殖和趋化能力的影响,体外分析CXCL16在H/RS微环境形成中的可能作用。研究内容与方法：1. CXCL16及其受体CXCR6在不同来源的淋巴瘤细胞的表达通过荧光定量PCR、免疫印迹（Western blot）、免疫荧光共聚焦（confocal）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测CXCL16/CXCR6在7株B细胞来源（cHL细胞株L428,DLBCL细胞株OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10, EB病毒阳性伯基特淋巴瘤细胞株Raji细胞,多发性浆细胞性骨髓瘤细胞株RPMI-8226、KM3）和2株T细胞来源淋巴瘤细胞株（间变性大细胞淋巴瘤细胞株Karpass299,急性T细胞白血病细胞株Jurkat）的表达及差异。2. CXCL16与CD99表达相关性及NF-κB信号通路的影响利用课题组前期构建的过表达CD99的L428亚系（L428-CD99+）和低表达mCD99L2的A20细胞亚系（A20- mCD99L2-细胞）,通过细胞的形态学观察、荧光定量PCR检测CD99、CXCL16mRNA的表达,ELISA检测细胞sCXCL16蛋白的分泌,Westernblot检测CD99、CXCL16和p-IκBα蛋白的表达,分析CXCL16与CD99表达的相关性。通过使用NF-κB信号通路激活剂和抑制剂,观察调节NF-κB信号通路对CXCL16和CD99表达的影响。3. CXCL16在cHL微环境形成中的作用采用人CD4免疫磁珠分离方法从健康人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）分离得到CD4+T淋巴细胞,与L428细胞进行共培养以体外模拟cHL的微环境,通过CCK8增殖实验检测与CD4+T细胞共培养后的L428细胞增殖能力的变化；而后分别以无血清培养的L428细胞上清及不同浓度人CXCL16细胞因子在不同组合条件下作为条件培养基（conditioned media,CM）,通过趋化实验方法检测CD4+T淋巴细胞趋化能力的变化,分析趋化因子sCXCL16在体外模拟的H/RS细胞微环境中的作用。4.统计学处理采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数标准差（x±s）表示。Real-time PCR检测CXCL16的表达水平及流式细胞仪计数CXCL16对CD4+T细胞的趋化能力采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）.CCK8法检测细胞增殖能力采用析因设计资料的方差分析和单因素方差分析（One-Way ANOVA）,多重比较选用LSD法比较各组间差异。P<0.05,差异具有统计学意义。结果：一、CXCL16/CXCR6淋巴瘤细胞水平的表达1.荧光定量PCR检测CXCL16 mRNA表达水平,结果发现：以L428细胞为对照,OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10、Karpass299、Raji细胞的CXCL16 mRNA表达水平分别是L428细胞的0.454±0.024、0.430±0.046、0.443±0.046、0.233±0.054和0.219±0.047倍,L428细胞中CXCL16 mRNA的表达高于OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10、Karpass299、Raji细胞,两者相比较均有统计学差异（P<0.05）; RPMI-8226、KM3和Jurkat细胞CXCL16 mRNA的表达水平分别是L428细胞的4.115±0.234、4.378±0.339和5.687±0.194倍,均高于L428细胞中CXCL16的表达,两者相比较均有统计学差异（P<0.05）；以L428细胞为对照,OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10、Karpass299、Raji、 Jurkat细胞的CXCR6表达水平分别是L428细胞的6.946±0.781、7.762±0.357、7.330±0.794、15.702±1.495、5.068±0.785、9.548±1.284倍,高于L428细胞中CXCR6 mRNA的表达,两者相比较均有统计学差异（P<0.05）; RPMI-8226和KM3细胞CXCR6的表达水平分别是L428细胞的1.260±0.301和1.765±0.096倍,高于L428细胞中CXCR6的表达,两者相比较无统计学差异（P>0.05）：2.免疫印迹检测CXCL16.总蛋白水平,结果发现：CXCL16蛋白在多发性浆细胞骨髓瘤细胞株RPMI-8226、 KM3及急性白血病性淋巴瘤细胞Jurkat细胞呈高表达,在L428细胞相对高表达,在DLBCL、间变性大细胞淋巴瘤Karpass299及B细胞来源的伯基特（Burkitt’s）淋巴瘤细胞株Raji表达较低；CXCR6蛋白在DLBCL细胞株OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10、Karpass299、Raji及Jurkat细胞中表达较高,在L428及RPMI-8226、KM3细胞表达较低。3.荧光共聚集检测TM-CXCL16,结果发现：多发性浆细胞骨髓瘤细胞株RPMI-8226、KM3及急性白血病性淋巴瘤细胞Jurkat细胞内TM-CXCL16的表达高于L428细胞,L428细胞CXCL16蛋白的表达高于DLBCL细胞株OCI-Ly1、 OCI-Ly8、OCI-Ly10、间变性大细胞淋巴瘤Karpass299及B细胞来源的伯基特（Burkitt’s）淋巴瘤细胞株Raji细胞,与Western blotting检测CXCL16总蛋白结果基本一致。4. ELISA实验检测sCXCL16分泌水平,结果提示：OCI-Ly1、OCI-Ly8、 OCI-Ly10、Karpass299、Jurkat、Raji细胞CXCL16的分泌高于L428细胞,两者相比较均有统计学差异（P<0.05）；L428细胞CXCL16的分泌高于多发性浆细胞骨髓瘤细胞株RPMI-8226、KM3细胞,两者相比较均有统计学差异（P<0.05）。二、CXCL16与CD99、NF-κB信号通路的关系1.在传代过程中发现与A20细胞相比较,A20-mCD99L2-细胞的大细胞数量明显增多,胞浆较丰富,细胞核明显增大,出现较多双核、多核细胞；与L428细胞相比较,L428-CD99+细胞中的大细胞数量明显减少,细胞更具有一致性。2. Real-time PCR检测A20- mCD99L2-细胞中mCD99基因水平的表达为A20细胞的0.331±0.093倍,呈低水平表达（P<0.05）; A20-mCD99L2-细胞的mCXCL16 mRNA为A20细胞的2.440±0.156倍（P<0.05）；L428-CD99+细胞的hCD99基因是L428细胞的3.807±0.763倍（P<0.05）;L428-CD99+细胞的hCXCL16 mRNA为L428细胞的0.034±0.011倍（P<0.05）。3. Western blotting检测细胞CXCL16蛋白水平的表达：结果显示L428-CD99+细胞较对照组及空载细胞组CXCL16表达水平减低；而在A20-mCD99L2-细胞中CXCL16表达增高。4. Western blotting结果中A20-mCD99L2-细胞中mCD99蛋白弱于A20细胞,p-IκBα蛋白强于A20细胞；A20-mCD99L2-细胞经NF-κB信号通路抑制剂BAY处理对mCD99L2蛋白无影响,但p-IκBα和CXCL16蛋白表达显著下降；A20细胞经NF-κB信号通路激活剂LPS处理对mCD99L2蛋白无影响,但p-IκBα和CXCL16蛋白表达增强。Western blotting结果中L428细胞hCD99蛋白弱于L428-CD99+细胞；L428细胞经NF-κB信号通路抑制剂BAY处理对hCD99蛋白无影响,但p-IκBα和CXCL16蛋白表达水平明显下降；L428-CD99+细胞经NF-κB信号通路激活剂LPS处理对hCD99蛋白无影响,但p-IκBα和CXCL16蛋白表达增强。5. ELISA检测A20-mCD99L2细胞经NF-κB信号通路抑制剂BAY处理后其分泌CXCL16量为429.921±27.495,较处理前减少,差异具有显著性（P<0.05）；A20细胞经NF-κB信号通路激活剂LPS处理后其分泌CXCL16量为716.202±89.89,较处理前增加,差异具有显著性（P<0.05）。L428细胞经NF-κB信号通路抑制剂BAY处理后其分泌CXCL16的量为241.528±49.169,较处理前减少,差异具有显著性（P<0.05）；L428-CD99+细胞经NF-κB信号通路激活剂LPS处理后其分泌CXCL16的量为624.809±42.643,较处理前L428-CD99+增加,差异具有显著性（P<0.05）。三、sCXCL16对cHL微环境形成影响的初步研究1.CCK8法检测与CD4+T细胞共培养后L428细胞体外增殖能力,经析因设计资料的方差分析结果显示不同细胞组之间差异具有显著性（F=828.887,P<0.05）。两组细胞经LSD法多重比较显示共培养组增殖能力显著高于对照组,差异具有显著性（P<0.05）；2.检测加入重组蛋白CXCL16之后L428细胞体外增殖能力,经析因设计资料的方差分析结果显示不同细胞组之间差异无显著性（F=3.782,P>0.05）。两组细胞经LSD法多重比较显示实验组增殖能力与对照组无明显差异（P>0.05）。3.趋化实验检测细胞的趋化能力,结果提示以L428细胞无血清培养上清为对照,当加入CXCL16重组蛋白浓度分比为1 Ong/ml、20ng/ml、30ng/ml时, CD4+T细胞穿过小室的细胞数量流式细胞仪计数：分别为对照组的93980.00±62516.656、154229.3±55021.418和232090.3±61388.819倍,30ng/ml组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）；与10ng/ml组相比差异显著（P<0.05）。结论1.在淋巴瘤细胞株CXCL16及其受体CXCR6广泛表达,但是不同来源的细胞株表达水平存在差异。在人cHL L428细胞,TM-CXCL16和SCXCL16表达相对比较高,而CXCR6表达较低。2. L428-CD99+与A20-mCD99L2-细胞亚系中CXCL16的表达和分泌与CD99/mCD99L2表达呈负相关,且受NF-κB信号通路的影响：CD99基因表达与NF-κB活性呈负相关,而CXCL16表达与NF-κB活性呈正相关,且调控NF-κB信号通路的活性能够影响CXCL16的表达。3.体外模拟的H/RS细胞的微环境中,外源性CXCL16不影响H/RS细胞的增殖,但可以促进CD4+T细胞的趋化能力。创新之处1.本研究采用体外研究的多种方法,在]mRNA水平和蛋白水平检测了cHL和非霍奇金淋巴瘤中的多种类型细胞株中CXCL16、CXCR6的表达及差异,分析了]TM-CXCL16和SCXCL16表达的特征,首次系统研究了该趋化因子及受体在淋巴瘤细胞株中的表达,为深入研究奠定了基础,也为淋巴瘤生物治疗提供了潜在的靶点。2. 本研究将趋化因子CXCL16与前期的CD99研究相互联系,深化了本课题组前期的系列研究,并且通过观察NF-κB信号通路对CXCL16的影响,拓展了CXCL16、CD99和NF-κB三者之间的关系,为趋化因子网络及相关通路研究提供了思路。3. 本研究通过体外模拟H/RS细胞的微环境,初步研究了外源性CXCL16与免疫细胞的相互作用,为后续深入开展cHL微环境研究提供方法,也为探索CXCL16在肿瘤细胞与微环境相互作用中的重要意义提供了线索。
论文目录
相关论文文献
标签：经典型霍奇金淋巴瘤论文; 趋化因子论文; 趋化因子配体论文; 基因论文; 核因子论文;