用RNA干扰（RNAi）抗草鱼出血病病毒的初步研究

论文题目: 用RNA干扰（RNAi）抗草鱼出血病病毒的初步研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 遗传学

作者: 陈芸

导师: 朱作言

关键词: 干扰,草鱼出血病病毒,启动子,表达抑制,实时荧光定量

文献来源: 中国科学院研究生院（水生生物研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 转基因技术是20 世纪80 年代发展起来的一项重要技术,通过向受精卵或早期胚胎中导入外源DNA,能有目的地对生物的遗传物质基础进行修饰和改造,进而培养新的品系。鱼类转基因研究的一个重要方向就是定向育种,即通过转基因改良生产性状,如快速生长、抗病虫害、抗冻、抗盐碱等。草鱼(Grass carp ,Ctenopharyngodon idellus)是我国淡水养殖的主要品种之一,引起草鱼出血病的草鱼出血病病毒(Grass carp reovirus virus,GCRV)流行广、危害大、发病季节长,死亡率高达90%以上,严重阻碍了我国淡水养殖业的发展。目前对该病毒还没有有效防治的药物或方法,因而进行抗草鱼出血病病毒育种研究对淡水渔业的发展具有重要意义。由小的干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)介导的RNA 干扰(RNA interference,RNAi ) 是近年来快速发展的一种转录后基因沉默(post-transcrptional gene silencing,PTGS)方法。它是指当与内源性mRNA编码区某段序列同源的干扰RNA 导入细胞后,使该mRNA 发生特异性的降解,从而导致该基因的表达沉默。而且,利用H1-RNA 基因的启动子构建RNA 干扰载体,将这种载体导入到体内,可以长期稳定的表达小干扰RNA,使靶基因表达沉默。RNA 干扰现象是生物防范病毒或转座子诱导DNA 突变的一种防御机制,目前正在利用这一机制发展一种重要的基因治疗手段。基于以上认识,本研究将利用RNAi 技术,以草鱼出血病病毒为模型,结合转基因技术,对RNA 干扰在鱼类抗病毒病中的分子机理和应用前景展开探索性研究,以期为获得鱼类抗病新品系打下基础。另外,该模型的建立也将为鱼类基因功能和信号转导研究提供有效的手段。本论文主要进行了如下几个方面的研究: (1) H1 基因及其启动子的克隆:基于已知的人、鼠、斑马鱼等H1 基因序列,利用同源克隆法,设计简并引物,以草鱼基因组DNA 为模板进行PCR 扩增,克隆得到草鱼H1 基因301bp。随后根据克隆的H1 基因序列,设计特异引物,用TAIL-PCR 法克隆,得到H1 基因启动子738bp。(2) H1 启动子活性分析:为了筛选合适的启动子区段用于构建表达siRNA的载体,需对H1 启动子进行详细的活性分析。设计引物扩增三段不同长度的启

论文目录:

目录

中文摘要

英文摘要

略语表

第一章 文献综述及研究目标

1 关于草鱼出血病病毒

1.1 草鱼出血病病毒概况

1.2 草鱼出血病病毒引起的组织、细胞病变

1.3 草鱼出血病病毒的传统防治方法

1.4 关于实验材料及方法的选择

2 关于 RNA 干扰(RNAi)

2.1 RNAi 现象的发现

2.2 RNAi 的作用机制模型

2.3 RNAi 在哺乳类培养细胞中的应用

2.4 RNAi 的抗病毒研究

2.5 RNAi 在小鼠体内的作用

2.6 RNAi 在鱼类中的研究

2.7 RNAi 应用小结

2.8 siRNA 的设计

2.9 siRNA 表达载体

2.10 siRNA 的转移

2.11 RNAi 的局限性

2.12 RNAi 总结

3 研究方案及预期目标

第二章 草鱼H1基因及启动子克隆

1 材料和方法

1.1 实验鱼和取材

1.2 高质量基因组 DNA 制备

1.3 PCR 扩增草鱼 H1 基因

1.4 TAIL-PCR 方法克隆 H1 启动子

1.5 PCR 产物回收

1.6 PCR 产物的 T 载体克隆与测序

2 结果

2.1 草鱼 H1 基因克隆结果

2.2 草鱼 H1 基因启动子克隆结果

3 讨论

第三章 草鱼H1启动子活性分析

1 材料和方法

1.1 RNAi 载体的构建

1.2 基因转移

1.3 观察 GFP 在斑马鱼胚胎中的表达

1.4 胚胎总 RNA 制备

1.5 胚胎总蛋白提取

1.6 实时荧光定量 PCR 分析

1.7 Western blot 分析

2 结果

2.1 RNAi 载体的酶切及测序分析

2.2 GFP 在斑马鱼胚胎中的表达

2.3 实时荧光定量 PCR 检测 GFP mRNA 表达水平

2.4 Western blot 结果分析

3 讨论

第四章 不同形式不同浓度的小 RNA 对转录后基因沉默的影响

1 实验材料和方法

1.1 载体的准备

1.2 基因转移

1.3 观察 GFP 在斑马鱼胚胎中的表达

1.4 胚胎总 RNA 提取

1.5 胚胎总蛋白的提取

1.6 实时荧光定量 PCR 分析

1.7 Western Blot 分析

2 结果

2.1 GFP 在斑马鱼胚胎中的表达

2.2 实时荧光定量 PCR 结果

2.3 Western blot 分析结果

3 讨论

第五章 RNAi在草鱼细胞水平上对病毒复制的影响

1 实验材料和方法

1.1 病毒靶基因的选择

1.2 抗病毒 RNAi 载体 pH1siGCRV(x)-CMVeGFP 的构建

1.3 GCRV991 毒株滴度测定

1.4 转染

1.5 细胞攻毒

2 结果

2.1 GCRV991 毒株滴度测定结果

2.2 转染细胞空斑结果

3 讨论

第六章 RNAi在稀有鮈鲫体内的抗病活性研究

1 材料和方法

1.1 显微注射以及阳性鱼筛选

1.2 GCRV 病毒毒株 991 最佳攻毒剂量的确定

1.3 转基因稀有鮈鲫攻毒

1.4 RT-PCR 检测病毒颗粒在不同组织中的分布

1.5 实时荧光定量 PCR 分析不同基因的表达差异

2 结果

2.1 毒株991最佳攻毒剂量的确定

2.2 转基因稀有鮈鲫攻毒结果

2.3 RT-PCR 检测病毒颗粒在不同组织中的分布结果

2.4 荧光定量 PCR 分析不同基因的表达差异结果

3 讨论

第七章 总结

参考文献

附录一 论文中所用的引物以及寡核苷酸序列

附录二 主要试剂溶液及仪器

附录三 个人简历

致谢

发布时间: 2006-03-20

参考文献

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