利用天麻抗真菌蛋白基因（gafp）培育抗枯、黄萎病陆地棉的研究

论文摘要

棉花枯、黄萎病是棉花生产中最重要的真菌病害,已成为制约我国棉花生产的突出问题,实践证明选育和利用抗病棉花品种是最经济有效的方法。天麻抗真菌蛋白(gastrodia antifungal protein简称GAFP)是从我国传统中药天麻(Gastrodia elata Bl.)中分离得到的一种具有广谱抗真菌活性的蛋白质,它对许多植物真菌病的致病菌离体具有很强的抑制作用,因此在植物抗真菌病基因工程上有很重要的应用价值。通过转基因技术可以打破物种间的生殖隔离而充分利用自然界中的基因,为选育新品种提供了全新的和有效的辅助途径。 本研究首先通过花粉管通道转化法,将天麻抗真菌蛋白(GAFP)的基因gafp转入3个新疆陆地棉栽培品种(系)中,然后将所获得的转化植株后代在棉花枯、黄萎病混生病圃中进行抗病鉴定,通过筛选试图获得对黄、枯萎病的有显著抵抗能力的棉花新材料。主要研究结果如下: 1、优化了现有的花粉管通道法转化棉花的技术体系。为了提高花粉管通道法转化棉花的频率,研究了影响转化效率因素。发现进行注射的最佳时间为授粉后15～25小时,最适注射部位为棉花子房中座,质粒DNA的注射量为0.02～0.04ug/ul。 2、进行了陆地棉植株抗生素涂抹敏感性实验,确定了筛选的适宜浓度,卡那霉素涂抹筛选浓度为0.75～1.00%(w/v)。将所获得的转化后代在大田种植后经卡那霉素标记基因抗性筛选,获得抗性植株58株。 3、将所得到的抗卡那霉素58株阳性植株经枯、黄萎病混生病圃抗病性调查和鉴定、Southern点杂交及PCR扩增检测,证实得到了2株高抗枯、黄萎病的转基因植株。其后代经过进一步的抗病性筛选和鉴定以及选育利扩繁,发现转基因陆地棉后代具有稳定的、较强抗枯、黄萎病能力。 4、本研究工作为通过植物抗病基因工程的方法防治棉花枯、黄萎病提供了一条新的途径。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 课题的提出
• 1.2 植物抗病基因工程国内外研究现状
• 1.2.1 应用几丁质酶基因和β-1，3-葡聚糖酶基因
• 1.2.2 应用葡萄糖氧化酶基因
• 1.2.3 应用植物防卫素基因
• 1.2.4 应用其他抗真菌蛋白及其基因
• 1.2.5 GAFP是传统中约天麻中的一种重要功能蛋白
• 1.3 植物遗传转化研究进展
• 1.3.1 植物基因工程原理
• 1.3.2 遗传转化的转化方法
• 1.3.3 遗传转化在棉花上的应用
• 1.4 本课题的研究目的和意义
• 第二章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 棉花材料
• 2.1.2 人肠杆菌和质粒
• 2.1.3 部分试剂米源
• 2.1.4 PCR引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 gafp植物高效表达载体的构建
• 2.2.2 载体质粒提取与纯化
• 2.2.3 外源基因的转化——花粉管通道法的遗传转化
• 1代的抗病性鉴定'>2.2.4 转化体R₁代的抗病性鉴定
• 2.2.5 幼苗期卡那霉素涂抹初筛
• 2.2.6 病圃鉴定筛选及选育
• 2.2.7 转基因植株的分子检测
• 2.2.8 转基因陆地棉植株后代的PCR检测
• 2.2.9 转基因陆地棉植株后代的抗病性鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 实验结果
• 1代）'>3.1.1 花粉管通道法所获得的转基因植株（R₁代）
• 1代标记基因初筛'>3.1.2 转化植株R₁代标记基因初筛
• 1代的抗病性鉴定'>3.1.3 转化植株R₁代的抗病性鉴定
• 3.1.4 转基因植株的分子检测
• 3.1.5 转基因陆地棉植株后代的PCR检测
• 3.1.6 转基因陆地棉植株后代的抗病性鉴定
• 3.2 实验分析
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介