弓形虫病分子诊断方法及弓形虫分离株耐药性的研究

论文摘要

弓形虫病（Toxoplasmosis）是由刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的以孕妇（畜）流产、弱胎、畸胎、死胎和儿童（幼畜）生长受阻、死亡等为特征的人畜共患病。该病广泛存在于世界各地,宿主范围十分广泛,人及大多数动物感染率都较高,是人类优生的大敌,是当今新生儿致畸的四大病因之一。弓形虫病在猪场感染率高,严重影响着养猪业的发展。建立准确快速的诊断方法和研制安全高效疫苗是预防和控制弓形虫病的重要措施。MIC3是弓形虫在速殖子、缓殖子及子孢子期都表达的粘附蛋白,与弓形虫入侵宿主细胞密切相关,已证明其具有良好的免疫原性。本研究利用原核表达的弓形虫微线体蛋白3（MIC3）建立了SPA-ELISA和AG-ELISA检测方法,利用细胞培养方法从临床血清学阳性的病料中分离得到了10株弓形虫虫株,并对虫株的耐药性进行了研究。主要研究成果如下:本研究利用本室构建的pGEX-KG-MIC3质粒转化感受态细胞,确定了pGEX-KG-MIC3在E.coli BL21-CodonPlus菌株中高效表达的最佳条件,SDS-PAGE实验表明表达的融合蛋白分子量为66KD,表达产物经Western blot检测证实具有较强的免疫反应原性。利用纯化的重组蛋白rMIC3替代传统的虫体成份作为诊断抗原建立了SPA-ELISA和AG-ELISA诊断方法。这两种方法检测猪其它常见病原体阳性血清,结果全为阴性;SPA-ELISA和AG-ELISA分别能检测到1:6400和1:12800稀释血清中的抗T.gondii特异性抗体;诊断试剂的批内（间）重复试验,ELISA变异系数＜10%;在4℃贮存下诊断试剂的保质期均超过8个月。结果表明,本研究建立的两种诊断方法均具有良好的特异性、敏感性、稳定性及较长的保质期。为验证和比较SPA-ELISA和AG-ELISA的广适性,在临床上,检测了四种不同动物血清,共332份,并与MAT方法进行了比较,结果表明,除山羊血清外,SPA-ELISA对猪、犬、猫血清的阳性检出率均高于MAT方法,二者符合率超过90%。利用AG-ELISA检测四种动物血清,共304份,并与MAT方法进行比较,结果显示,AG-ELISA对四种动物血清的阳性检出率均高于MAT方法。说明了AG-ELISA具有更广泛的宿主适用范围。为进一步验证AG-ELISA的实际应用效果,利用已建立的AG-ELISA监测了人工感染弓形虫猪体内抗体水平的动态变化,同时用MAT方法及ELISAkit平行测定。结果表明,首次感染第10d,8头人工感染猪的AG-ELISA抗体均为阳性,第35d,AG-ELISA抗体水平达到高峰,随后缓慢下降,在第57d时仍可检测到ELISA抗体。Kappa一致性试验结果表明,AG-ELISA与MAT方法及ELISAkit符合良好。为提高弓形虫细胞分离的阳性率,对细胞培养条件进行了优化,结果显示,细胞培养的最佳条件为选用DMEM高糖培养基,加入1%血清和10%SRC。采集猪的抗凝全血,利用细胞培养方法进行了弓形虫虫株的分离。利用上述培养条件,对19份弓形虫AG-ELISA抗体阳性的抗凝血进行了弓形虫虫株的分离培养,经显微镜观察、PCR检测以及动物接种试验证明,成功地分离得到10株弓形虫分离株。耐药性试验初步显示其中的一株对磺胺类药物具有一定的抗药性。本研究建立的SPA-ELISA和AG-ELISA诊断方法,解决了目前弓形虫病不易快速、准确、简便诊断的难题,对多种动物弓形虫病的临床诊断、疾病控制等均具有重要意义。猪源弓形虫虫株的分离及磺胺耐药现象的初步证实,为弓形虫病的有效防治及合理用药奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1.1 弓形虫与弓形虫病的发现及其危害
• 1.1.1 弓形虫与弓形虫病的发现
• 1.1.2 弓形虫病的危害
• 1.1.3 猪弓形虫病与公共卫生的关系
• 1.2 弓形虫的病原学
• 1.2.1 弓形虫分类
• 1.2.2 弓形虫的各期形态结构
• 1.2.3 弓形虫生活史
• 1.2.4 流行病学
• 1.2.5 致病机制
• 1.2.6 抵抗力
• 1.3 弓形虫的主要基因与蛋白质
• 1.3.1 弓形虫表面抗原
• 1.3.2 弓形虫棒状体蛋白
• 1.3.3 弓形虫微线体蛋白
• 1.3.4 弓形虫致密颗粒蛋白
• 1.4 弓形虫病的免疫应答
• 1.4.1 先天性免疫
• 1.4.2 获得性免疫
• 1.5 弓形虫病的预防与治疗
• 1.5.1 弓形虫病的预防
• 1.5.2 弓形虫病的治疗
• 1.6 弓形虫病的诊断方法研究进展
• 1.6.1 病原学检查
• 1.6.2 免疫学检测
• 1.6.3 分子生物学诊断
• 1.6.4 目前我国弓形虫病检测试剂（盒）面临的问题
• 1.7 抗体结合蛋白研究进展
• 1.7.1 金黄色葡萄球菌蛋白A
• 1.7.2 链球菌G蛋白
• 1.8 弓形虫体外培养的研究进展
• 1.8.1 弓形虫体外培养概况
• 1.8.2 弓形虫体外培养技术的应用
• 1.8.3 展望
• 第二章 MIC3在大肠杆菌中的高效表达
• 2.1 研究的目的意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.1.1 质粒、菌株、虫株及实验动物
• 2.2.1.2 主要药品及试剂
• 2.2.1.3 主要试剂及溶液的配制
• 2.2.2 试验方法
• 2.2.2.1 兔抗弓形虫高免血清的制备
• 2.2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.2.3 连接产物及质粒的转化
• 2.2.2.4 质粒的小量制备（碱裂解法）
• 2.2.2.5 诱导表达
• 2.2.2.6 最佳诱导表达条件的确定
• 2.2.2.7 不溶性表达产物（包涵体）的提取、溶解和复性
• 2.2.2.8 SDS-PAGE电泳
• 2.2.2.9 Western blot试验
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 克隆基因的选择
• 2.3.2 重组质粒在E.coli中的表达与表达产物分析鉴定
• 2.3.5 最佳诱导表达条件的确定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 原核表达载体的选择
• 2.4.2 包涵体的提取和纯化
• 2.5 小结
• 第三章 动物弓形虫病SPA-ELISA及AG-ELISA诊断方法的建立
• 3.1 研究的目的意义
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.1.1 试验动物
• 3.2.1.2 主要药品及试剂
• 3.2.1.3 血清
• 3.2.1.4 ELISA缓冲液
• 3.2.2 试验方法
• 3.2.2.1 SPA-ELISA方法的建立
• 3.2.2.2 AG-ELISA方法的建立评价
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 SPA-ELISA方法的建立
• 3.3.1.1 抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定
• 3.3.1.2 封闭液浓度及封闭时间的确定
• 3.3.1.3 最适血清工作时间的确定
• 3.3.1.4 酶标SPA最适浓度和最适作用时间的确定
• 3.3.1.5 底物作用时间的确定
• 3.3.1.6 SPA-ELISA的结果判定
• 3.3.1.7 特异性试验
• 3.3.1.8 敏感性试验
• 3.3.1.9 重复性试验
• 3.3.1.10 保质期试验
• 3.3.1.11 临床动物血清样品的检测
• 3.3.2 AG-ELISA方法的建立
• 3.3.2.1 抗原最佳包被浓度及血清最佳稀释倍数的确定
• 3.3.2.2 HRP-AG最适浓度和最适作用时间的确定
• 3.3.2.3 底物作用时间的确定
• 3.3.2.4 SPA-ELISA的结果判定
• 3.3.2.5 特异性试验
• 3.3.2.6 敏感性试验
• 3.3.2.7 重复性试验
• 3.3.2.8 保质期试验
• 3.3.2.9 临床动物血清样品的检测
• 3.3.2.10 AG-ELISA在人工感染猪血清弓形虫抗体检测中的应用
• 3.3.2.11 AG-ELISA在临床血清弓形虫抗体检测中的实际应用
• 3.4 讨论
• 3.4.1 SPA-ELISA及AG-ELISA方法的建立
• 3.4.1.1 ELISA方法的种属限制
• 3.4.1.2 AG-ELISA及SPA-ELISA判定标准的制定
• 3.4.1.3 AG-ELISA及SPA-ELIS诊断方法的评价
• 3.4.2 试验条件的优化
• 3.4.2.1 抗原对ELISA的特异性和敏感性的影响
• 3.4.2.2 抗原包被浓度的影响
• 3.4.2.3 血清对ELISA的特异性和敏感性的影响
• 3.4.2.4 封闭液的选择
• 3.4.3 ELISA操作方法的标准化
• 3.4.3.1 加样
• 3.4.3.2 温育
• 3.4.3.3 洗涤
• 3.4.3.4 比色
• 3.5 小结
• 第四章 弓形虫虫株分离及其耐药现象的初步研究
• 4.1 研究的目的与意义
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 虫株、细胞、血清及实验动物
• 4.2.1.2 主要溶液的配制
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 细胞的复苏和传代培养
• 4.2.2.2 RH株速殖子培养上清的制备
• 4.2.2.3 分离虫株所用细胞系的确定
• 4.2.2.4 细胞培养分离虫体所需条件的优化
• 4.2.2.5 野生虫株的分离
• 4.2.2.6 分离虫株的进一步鉴定
• 4.2.2.7 弓形虫磺胺耐药株的筛选及初步确定
• 4.3 结果
• 4.3.1 细胞培养条件的优化
• 4.3.2 野生虫株的分离及其鉴定
• 4.3.2.1 临床样品的预处理
• 4.3.2.2 野生虫株的分离
• 4.3.2.3 弓形虫分离株的进一步鉴定
• 4.3.3 弓形虫磺胺耐药株的筛选及初步确定
• 4.3.3.1 弓形虫分离株的体外抑制试验
• 4.3.3.2 弓形虫分离株的体内抑制试验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 细胞培养条件的优化
• 4.4.2 样品的选择与处理
• 4.4.3 弓形虫耐药性的初步确定
• 4.5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢