抗幽门螺杆菌UreB及HpaA抗原单抗的制备及临床应用探索

论文摘要

目的:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,Hp）是一种定植于胃内的革兰氏染色阴性、螺杆状、微需氧菌,目前全球近50%的人口感染了Hp,在发展中国家,其感染率可达到70%以上。因此,建立无创、便捷、廉价的检测方法对Hp的早期诊断具有重要的应用价值。目前,Hp的诊断方法主要有侵入性和非侵入性,非侵入性因为良好的病人依从性而倍受青睐。而非侵入性方法中,血清学实验在年轻患者中准确性不高,而13C尿素呼吸实验很昂贵,因而有必要寻找一种准确性高、无创、简便、价廉的诊断Hp感染的新方法。由于Hp是经粪-口传播,因此,以ELISA方法检测粪便中Hp抗原（H pylori stool antigen EIA ,HpSA）就成为可能。自从1998年HpSA检测被FDA批准在临床应用后该方法就在世界各国被评价,平均敏感性和特异性可达到90-98%,HpSA检测是一种廉价、实用的方法,不仅适用于治疗前和治疗后的诊断,而且对于各年龄段的儿童准确性均很高。Hp尿素酶B亚单位（urease B unit,UreB）和Hp粘附素A亚单位（Helicobacter pylori adhesin A unit,HpaA）均是位于Hp菌体表面的蛋白,在Hp各菌株中甚至球形体中都保守存在,其中UreB含量较高,占菌体总蛋白2.5-5%,而HpaA蛋白特异性较好,本研究拟通过制备抗Hp尿素酶B亚单位蛋白和鞭毛粘附素蛋白A蛋白的单克隆抗体,对抗体特性进行鉴定,建立夹心ELISA检测体系,对人粪便样本进行检测,为Hp临床诊断奠定基础。方法:1.抗UreB和抗HpaA单克隆抗体的制备采用杂交瘤技术制备抗UreB和HpaA单克隆抗体,对比硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法、蛋白A柱亲和层析法三种纯化方法对单抗亲和力的影响,从而确定最佳纯化方案。2.抗UreB和抗HpaA单克隆抗体特性的鉴定以非竞争ELISA法测定单抗的亲和常数;以ELISA相加实验初步确定单抗识别的表位;以间接荧光法分析单抗与Hp表面蛋白结合特性,以Western blot鉴定单抗与重组蛋白、Hp标准菌株、Hp临床分离株、Hp球形体的反应性,与肠致病性大肠杆菌、普通变形杆菌、绿脓杆菌、克雷白

论文目录

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• 论文正文 抗幽门螺杆菌UreB 及HpaA 单抗的制备及临床应用探索
• 前言
• 第一部分 抗幽门螺杆菌UreB 及HpaA 单克隆抗体的研制
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 抗rUreB 及rHpaA 单克隆抗体的制备
• 2.1.1 rUreB 及rHpaA 免疫抗原的制备及动物的免疫
• 2.1.2 ELISA 检测血清效价
• 2.1.3 滋养细胞的制备
• 2.1.4 免疫小鼠脾细胞的收集
• 2.1.5 小鼠SP2/0 骨髓瘤细胞的准备
• 2.1.6 细胞融合
• 2.1.7 杂交瘤细胞的选择性培养
• 2.1.8 杂交瘤细胞的筛选
• 2.1.9 阳性杂交瘤细胞的克隆化—有限稀释法
• 2.1.10 阳性杂交瘤细胞株的建立
• 2.1.11 杂交瘤细胞的扩增与冻存
• 2.1.12 腹水单克隆抗体的制备
• 2.1.13 单克隆IgG 类抗体的纯化
• 2.1.14 采用SDS-PAGE 分析单克隆抗体纯度
• 2.1.15 间接ELISA 法测定抗体相对亲和力
• 3 结果
• 3.1 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
• 3.2 腹水IgG 类单克隆抗体的纯化
• 3.3 间接ELISA 法测定抗体相对亲和力
• 4 讨论
• 4.1 免疫抗原的选择
• 4.2 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与筛选
• 4.3 腹水中IgG 类单克隆抗体的纯化
• 5 小结
• 第二部分 抗rHpaA 和rUreB 单克隆抗体的特性研究
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 Hp 菌株的培养
• 2.2 单克隆抗体的亲和常数测定
• 2.3 抗体识别抗原表位的测定
• 2.4 间接免疫荧光检测单抗与Hp 表面结合反应
• 2.5 Western blotting 鉴定单克隆抗体特异性
• 2.6 杂交瘤细胞株稳定性的测定
• 3 结果
• 3.1 抗HpaA 和UreB 单克隆抗体亲和常数的测定
• 3.2 单克隆抗体识别抗原表位的测定
• 3.3 间接免疫荧光法检测单抗与Hp 表面蛋白结合反应
• 3.4 western blot 鉴定单克隆抗体的特异性
• 3.5 杂交瘤分泌抗体的稳定性
• 4 讨论
• 4.1 单克隆抗体的亲和力
• 4.2 单克隆抗体识别抗原表位分析
• 4.3 间接免疫荧光分析单抗与Hp 表面蛋白结合反应
• 4.4 Western blot 分析单克隆抗体作用抗原的特异性
• 4.5 杂交瘤细胞及其抗体分泌稳定性
• 5 小结
• 第三部分 抗UreB 和HpaA 单克隆抗体临床应用初探
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 双抗夹心ELISA 方法的建立
• 2.1.1 抗幽门螺杆菌多克隆抗体的制备及纯化
• 2.1.2 双抗夹心ELISA 操作程序
• 2.1.3 最适反应条件的选择
• 2.2 夹心ELISA 检测系统的的特异性
• 2.3 最低检出限的确定
• 2.4 粪便样品的检测
• 3 结果
• 3.1 Hp 免疫日本大耳兔效果检测
• 3.2 兔抗Hp 多抗纯化效果
• 3.3 夹心ELISA 最适反应条件的确定
• 3.4 夹心ELISA 检测系统的特异性
• 3.5 最低检出限的确定
• 3.6 粪便样品的检测
• 4 讨论
• 4.1 双抗夹心ELISA 方法的建立
• 4.1.1 ELISA 最适反应条件的确定
• 4.1.2 夹心ELISA 系统的特异性
• 4.1.3 夹心ELISA 系统的最低检出限
• 4.2 粪便样本的检测
• 5 小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 文献综述 Hp 感染的临床非侵入性诊断方法评价及研究进展
• 研究生期间撰写、发表文章