窖蛋白-1在肝细胞增殖及肝再生中的作用研究

论文摘要

胞膜窖（caveolae）是细胞质膜表面直径为50100nm的烧瓶状内陷微区。作为质膜上的独立结构,胞膜窖参与多种细胞活动,如胆固醇转运、细胞内吞（endocytosis）、细胞膜组装、信号转导、肿瘤生成等。窖蛋白-1（caveolin-1,Cav-1）是组成胞膜窖的主要功能蛋白,它与窖蛋白-2形成稳定的异源寡聚体,在内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和脂肪细胞等分化细胞中含量丰富。肝脏是人体代谢的中心站,含有极其丰富的磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC）。在哺乳动物肝脏中,除了CDP-胆碱通路（Kennedy通路）外,还存在一条特有的PC合成通路,即磷脂酰乙醇胺N一甲基转移酶（phosphatidylethanolamine N-methyltransferase, PEMT）催化磷脂酰乙醇胺甲基化生成PC的PEMT通路。研究发现,肝病时合成PC的PEMT活性降低。本实验室曾在大鼠肝癌细胞CBRH-7919中过表达PEMT2,发现其生长被显著抑制,并被诱发细胞凋亡。提示,肝脏中脂质代谢与肝细胞增殖的调控密切相关。事实上,窖蛋白-1对细胞增殖和脂肪形成都具有调节作用。一方面,在包括乳腺癌在内的多种癌细胞内,Cav-1表达下调;窖蛋白-1可以通过其N端的脚手架区（caveolin scaffolding domain, CSD）寡聚Erk1/2的上游蛋白,抑制Erk1/2的活化,从而抑制细胞增殖和肿瘤转移。因此,窖蛋白-1通常被认为是候选的肿瘤抑制基因。但在个别癌症如膀胱癌、食道癌、甲状腺癌及前列腺癌中,Cav-1表达上调,提示Cav-1可能在这些癌症中起促肿瘤生成作用。另一方面,甘油三酯为肝再生提供能量并为新生细胞膜形成提供不饱和脂肪酸,甘油三酯的聚集是肝再生活动中的重要事件。最新的研究表明,窖蛋白-1通过促进甘油三酯的储存和利用而对肝再生起重要的调控作用。因此可以说,窖蛋白-1同时具有抑制细胞增殖和促进肝再生的双重作用,但目前Cav-1在正常肝细胞增殖和转化中的作用及机制尚不十分清楚。为探讨窖蛋白-1对正常肝实质细胞增殖所起的作用,本文构建了窖蛋白-1特异性的短发夹RNA表达载体psiRNA-CAV3、psiRNA-CAV6和psiRNA-CAV7;其中,psiRNA-CAV7被转染至人张氏肝细胞系,并使用抗生素Zeocin筛选,得到Cav-1表达稳定下调的细胞株CAV7,而载体psiRNA-CAV3和psiRNA-CAV6做瞬时转染。MTT法检测CAV7细胞增殖的变化,Western Blot检测Erk1/2和Akt等增殖生长相关信号蛋白表达和活性的变化。探讨体外下调张氏肝细胞内窖蛋白-1的表达对人肝细胞增殖的影响,以及产生影响的可能分子机制。同时,本文还检测大鼠肝再生过程细胞内Cav-1及Erk1/2表达的变化,试图探讨窖蛋白-1在肝再生中所起作用及可能的信号转导机制。实验得到的结果包括:（1）正常张氏肝细胞有高水平的Cav-1表达,稳定转染psiRNA-CAV1后,Cav-1表达减少约70%;Cav-1表达下调后,肝细胞的增殖先变快（24和72小时, P<0.05; 96小时, P<0.01）,后减慢。（2） CAV7细胞内Cav-1下调后肝细胞内Akt和Erk1/2蛋白的激活受到抑制,细胞的增殖可能因此减慢。（3）瞬时转染的CAV3和CAV6细胞至120小时Cav-1表达下调后,Erk1/2蛋白被激活,提示Cav-1对Ras-Erk1/2通路具有抑制作用。（4）无论瞬时还是稳定转染组,Cav-1下调后肝细胞内SAPK/JNK蛋白活性始终受抑制,而c-myc表达持续升高。（5）肝再生过程中,细胞内caveolin-1的表达在肝切除手术后24小时达到最高,并在96小时仍维持一定的高水平,提示其在肝再生中可能发挥作用;同时,Erk1/2的表达增加,并在术后96小时达到最高。综合已有的研究,本文得到以下结论:（1）窖蛋白-1可能通过参与跨膜信号转导影响Akt、Erk、JNK、c-myc等多个相关信号分子活性,从而调控正常肝实质细胞增殖。（2）窖蛋白-1可能通过调控肝细胞内甘油三酯代谢而在肝再生中起重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 窖蛋白-1 在肝细胞增殖和肝再生中作用的研究进展
• 1.1 胞膜窖和窖蛋白
• 1.2 窖蛋白-1 参与细胞增殖及癌变的调控
• 1.2.1 窖蛋白-1 参与细胞周期进程的调控
• 1.2.2 窖蛋白-1 参与生长增殖信号通路的调控
• 1.2.3 窖蛋白-1 与细胞癌变调控
• 1.3 窖蛋白-1 参与肝再生的调控
• 1.3.1 肝再生及部分肝切除手术
• 1.3.2 窖蛋白-1 通过促进脂滴形成参与肝再生过程
• 1.3.3 肝再生的信号转导机制
• 1.4 结语
• 第二章 短发夹状 RNA 干扰窖蛋白-1 表达对人肝细胞增殖的影响
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料和仪器
• 2.1.1.1 细胞系
• 2.1.1.2 主要药品和试剂
• 2.1.1.3 仪器
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.2.1 溶液的配制
• 2.1.2.2 窖蛋白-1 特异性shRNA 转录模板的设计及表达载体的构建
• 2.1.2.3 细胞的培养与转染
• 2.1.2.3.1 冻存细胞的复苏
• 2.1.2.3.2 酶消化法传代
• 2.1.2.3.3 细胞转染
• 2.1.2.4 MTT 法检测 Cav-1 下调对肝细胞增殖的影响
• 2.1.2.5 免疫印记检测
• 2.1.2.6 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 重组载体psiRNA-CAV 的鉴定
• 2.2.2 RNA 干扰使肝细胞窖蛋白-1 的表达下调
• 2.2.3 窖蛋白-1 下调对肝细胞增殖的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 窖蛋白-1 表达下调对肝细胞增殖相关信号分子表达的影响
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料和仪器
• 3.1.1.1 主要药品和试剂
• 3.1.1.2 仪器
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 溶液的配制
• 3.1.2.2 肝细胞蛋白质提取液的制备及蛋白质浓度的测定
• 3.1.2.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 3.1.2.4 免疫印迹检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 Cav-1 表达下调对人肝细胞内Akt 表达的影响
• 3.3.2 Cav-1 表达下调对人肝细胞内Erk 表达的影响
• 3.3.3 Cav-1 表达下调对人肝细胞内SAPK/JNK 表达的影响
• 3.3.4 Cav-1 表达下调对人肝细胞内c-myc 表达的影响
• 3.4 讨论
• 第四章 肝再生过程中Cav-1及增殖相关信号蛋白表达的变化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料和仪器
• 4.1.1.1 实验动物
• 4.1.1.2 主要药品和试剂
• 4.1.1.3 仪器
• 4.1.2 实验方法
• 4.1.2.1 动物分组及再生肝模型制备
• 4.1.2.2 动物取材
• 4.1.2.3 肝组织蛋白质提取液的制备及免疫印记检测
• 4.1.2.4 统计分析
• 4.2 结果
• 4.2.1 肝切除手术后再生肝的生长变化
• 4.2.2 肝再生过程中窖蛋白-1的表达变化
• 4.2.3 肝再生过程中增殖信号蛋白的表达变化
• 4.3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介