番茄和辣椒抗根结线虫基因的克隆与鉴定

论文摘要

植物根结线虫（Meloidogyne spp．）病是一种世界性病害，严重威胁作物的生产。据统计，在引起植物侵染性病害的四大病原中，植物寄生线虫的危害超过细菌和病毒，仅次于真菌。世界上每年因植物寄生线虫造成的农业生产总损失达1250亿美元。目前生产上对根结线虫的防治，仍缺乏直接有效的方法，主要以化学药剂防治为主，但是化学杀线剂残留时间长、毒性大等问题难以解决，严重污染环境。选育和利用抗性作物品种是最经济、有效和安全的根结线虫防治途径。本研究的目的：利用分子生物学手段分别从抗根结线虫的番茄（Solanum lycopersicum Mill）和辣椒（Capsium annuum L．）材料中克隆抗性基因SlMi及CaMi，并利用农杆菌介导的遗传转化方法将它们转入根结线虫敏感的番茄中，分析转基因植株的抗性，鉴定其功能，获得抗根结线虫的番茄转基因株系，应用于植物抗根结线虫育种。本研究获得的主要结果如下：1．根据GenBank中已公布的Mi基因（AF039682）序列信息，成功克隆了番茄根结线虫抗性基因SlMi，该基因gONA序列长5345bp，cDNA长3964bp，含有两个内含子，CDS长3774 bp，编码1257个氨基酸。2．根据NBS-LRR保守序列设计简并引物从辣椒中获得24条具有完整ORF的抗病基因同源序列（RGAs）。对这24条RGAs进行结构功能域分析发现这些RGAs都包含NBS-LRR类抗病基因所有的保守结构域。聚类分析发现这些RGAs可分为八大类；推导的氨基酸相似性比对结果表明，这24个辣椒RGAs与12C-1相应区域氨基酸相似性为31-41％；与pry相应区域氨基酸相似性为32-97％；与RPM1相应区域氨基酸相似性为26-34％；与Hero相应区域氨基酸相似性为43-95％，与Mi相应区域氨基酸相似性为39-99％。其中p20与Mi基因氨基酸的相似性达99％，初步确认p20就是辣椒根结线虫抗性基因的一部分。3．利用同源序列法从抗性辣椒中克隆了辣椒根结线抗性基因CaMi，GenBank登录号为DQ465824。该基因gDNA长5355bp，生物信息学工具软件分析，预计该基因含有两个内含子，大小分别为1297 bp和72 bp。mRNA长3986bp，其中5’非编码区为86bp，3’非编码区为126 bp，CDS长3774 bp，编码1257个氨基酸，对该基因cDNA推断的蛋白质进行同源性分析，发现与番茄抗根结线虫基因SlMi的同源性达99％，两基因的差别主要体现在两个内含子中，同源性仅为92％和80％。两基因均属于第一类NBS-LRR抗病基因，含有NBS-LRR全部保守功能域。4．对抗性番茄和辣椒不同器官（根、茎、叶、花、果）的RT-PCR分析发现，SlMi基因在番茄根、茎和叶中均有表达，但在根和叶中表达量较高，茎中很微弱，几乎检测不到，而在花和果实中则无法检测到该基因的表达。CaMi基因在辣椒根、茎、叶、花中均有表达，和SlMi基因相似，在根和叶中的表达量较高，而茎中几乎检测不到，花中的表达量也相对较高。推断这两个基因的表达均具有时间和空间特异性。5．Southern杂交分析初步确定CaMi以三个拷贝的形式存在于抗根结线虫辣椒基因组中。6．构建了SlMi基因的正义及RNAi植物遗传转化载体和CaMi基因的正义遗传转化载体。利用农杆菌介导的遗传转化方法将正义SlMi和CaMi基因分别成功导入根结线虫敏感的番茄品种“中蔬5号”和“加八”中；将RNAi-SlMi基因导入抗根结线虫的番茄品种“抗根结线虫一号”。PCR检测和Southern blot结果表明，外源基因已整合到番茄基因组中。7．部分转基因植株的RT-PCR分析结果表明，多数转正义基因植株能够检测到靶基因的表达，而部分RNAi转基因植株靶基因的表达受到明显的抑制。8．转基因植株的根结线虫抗性评价结果显示多数正义基因转基因植株的抗性较敏感番茄非转基因植株有明显的提高，而部分RNAi转基因植株则丧失对根结线虫的抗性。9．石蜡切片分析结果表明，根结线虫侵染后造成根部组织结构显著的变化。RNAi转基因植株根部可以看到根结线虫的移动轨迹，根结线虫周围存在许多多核的巨细胞：而在正义转基因植株中则可看到因过敏性反应造成的坏死细胞。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 课题的提出
• 2 线虫的类型
• 2.1 活动性外寄生线虫
• 2.2 固着性外寄生线虫
• 2.3 活动性内-外寄生线虫
• 2.4 活动性内寄生线虫
• 2.5 固着性内寄生线虫
• 3 线虫的危害
• 3.1 线虫食道腺分泌物在致病中的重要作用
• 3.2 线虫与其他病原相互作用
• 4 蔬菜根结线虫病的症状及加重的原因
• 4.1 蔬菜根结线虫病的症状
• 4.2 蔬菜根结线虫病加重的原因
• 4.2.1 蔬菜种植面积加大,复种指数增加
• 4.2.2 保护地种植面积迅速扩大
• 4.2.3 茬口安排不当
• 4.2.4 使用带病菜苗,使发病面积迅速扩大,病情加重
• 4.2.5 防治方法单一,菜农片面追求化学防治
• 5 生产上对根结线虫的防治
• 5.1 农业措施
• 5.2 物理防治
• 5.3 化学防治
• 5.4 生物防治
• 6 植物抗病基因的研究进展
• 6.1 植物抗病基因的克隆方法
• 6.1.1 功能克隆——根据植物基因表达的产物蛋白质克隆基因
• 6.1.2 定位克隆——根据连锁图谱定位基因来克隆植物基因
• 6.1.3 转座子标签法（Transposon Tagging）
• 6.1.4 抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）
• 6.1.5 基因芯片技术（Gene Chips）
• 6.1.6 同源序列法——根据基因的已知同源序列克隆基因
• 6.2 抗病基因的类型
• 7 生物技术在抗线虫上的应用
• 7.1 利用生物技术的抗线虫策略
• 7.1.1 植物抗体策略
• 7.1.2 蛋白酶抑制剂策略
• 7.1.3 抗线虫取食位点策略
• 7.2 抗线虫基因的克隆
• 8 本研究的目的和内容
• 第二章 番茄抗根结线虫基因SlMi的克隆与鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
• 2.2 SlMi基因的克隆
• 2.3 SlMi基因的表达分析
• 2.4 植物表达载体的构建
• 2.4.1 正义（超量）表达载体的构建
• 2.4.2 RNAi抑制表达载体的构建
• 2.5 番茄遗传转化
• 2.6 转基因番茄植株的分子检测
• 2.6.1 转基因番茄植株的PCR检测
• 2.6.2 转基因番茄植株的Southern杂交分析
• 2.6.3 转基因番茄植株的RT-PCR分析
• 2.7 转化植株的抗性评价
• 2.8 根部组织石蜡切片观察
• 3 结果与分析
• 3.1 番茄抗性材料的PCR鉴定
• 3.2 SlMi基因的克隆与序列分析
• 3.3 SlMi基因在番茄不同器官中的表达分析
• 3.4 SlMi基因植物表达载体的构建
• 3.4.1 SlMi基因正义植物表达载体的获得
• 3.4.2 RNAi抑制表达载体的构建
• 3.5 转基因植株的获得
• 3.6 转基因番茄植株的分子检测
• 3.6.1 转基因植株的PCR检测
• 3.6.2 转基因植株的Southern杂交分析
• 3.6.3 转基因植株的RT-PCR分析
• 3.6.3.1 SlMi基因的正义转基因植株的RT-PCR分析
• 3.6.3.2 SlMi基因的RNAi转基因植株的RT-PCR分析
• 3.7 转基因植株根结线虫抗性鉴定
• 3.7.1 转正义SlMi基因植株根结线虫抗性评价
• 3.7.2 转RNAi植株根结线虫抗性评价
• 3.8 根部石蜡切片观察结果
• 3.9 转基因植株后代的遗传分析
• 4 讨论
• 4.1 基因克隆过程中的问题
• 4.2 转基因植株抗根结线虫的效果
• 4.3 转基因沉默现象
• 4.4 RNAi对内源基因的抑制
• 第三章 辣椒抗根结线虫基因的克隆与鉴定
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株、质粒及试剂
• 2.3 辣椒总DNA的提取
• 2.4 简并引物的设计及PCR扩增
• 2.5 阳性克隆的鉴定、测序及序列分析
• 2.6 CaMi基因的克隆与序列分析
• 2.7 正义（超量）表达载体的构建
• 2.8 3’RACE扩增
• 2.9 Southern杂交分析
• 2.10 RT-PCR分析
• 2.11 番茄遗传转化
• 2.12 转基因植株的分子鉴定及根结线虫抗性评价
• 3 结果与分析
• 3.1 辣椒RGAs的分离与克隆
• 3.2 辣椒RGAs阳性克隆测序及序列聚类分析
• 3.3 辣椒RGAs与已知的植物抗病基因相应区域的氨基酸序列相似性比较
• 3.4 CaMi基因的克隆
• 3.5 3’RACE
• 3.6 正义（超量）表达载体的构建
• 3.7 CaMi基因的序列分析
• 3.8 CaMi基因与Mi基因的比较
• 3.9 CaMi基因在辣椒基因组中的分布
• 3.10 CaMi基因在辣椒不同组织中的表达分析
• 3.11 CaMi转基因番茄植株的获得
• 3.12 转基因番茄植株的分子检测
• 3.12.1 转基因植株的PCR检测
• 3.12.2 CaMi转基因番茄植株的Southern杂交分析
• 3.12.3 转基因植株的RT-PCR分析
• 3.13 转基因植株的抗性评价
• 4 讨论
• 4.1 抗病基因的克隆
• 4.2 CaMi与Mi基因的关系
• 4.3 CaMi基因与已定位的辣椒抗根结线虫基因的关系
• 4.4 CaMi基因的利用前景
• 第四章 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录一:植物DNA的小量法提取程序
• 附录二:TriZOL一步法提取植物总RNA方法
• 附录三:质粒的小量提取方法
• 附录四:Southern Blotting程序
• 附录五:24个RGAs的核苷酸及氨基酸序列
• 附录六:登记基因信息
• 附录七:质粒图
• 附录八:博士在读期间已接受的文章及会议论文摘要