论文摘要
近年来,胰腺癌的发病率呈逐年上升趋势。在美国,每年新增胰腺癌病例约27000例,年死亡病例约26000例,其死亡率位居肿瘤死因的第四位;在中国,胰腺癌也位居肿瘤死因前10位。大多数患者在确诊时已发生转移,失去根治性手术切除时机,5年生存率低,预后极差。尽管胰腺癌的发病形势日益严峻,死亡率一直居高不下,但目前关于胰腺癌发病的分子机制还未完全阐明。这大大限制了胰腺癌治疗领域的发展。因此,迫切需要深入探讨胰腺癌发生、发展的分子机制,以寻找早期诊断与治疗胰腺癌的新途径。表观遗传学改变是在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因表型发生可遗传性的变化。其作用机制是通过DNA甲基化和组蛋白修饰,调控细胞在适当的时间和空间位置表达适当的基因,从而控制细胞的增殖、分化。表观遗传编码紊乱常常参与肿瘤的发生。DNA甲基化是重要的基因表观修饰方式之一。DNA甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferases,DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶转变为5′甲基胞嘧啶。哺乳动物体内的DNMTs家族包括DNMT1,DNMT2,DNMT3a和DNMT3b。其中,DNMT1主要负责维持DNA甲基化。在肿瘤基因组中,DNA甲基化改变总的特征是广泛低甲基化和部分区域的高甲基化共存。最近研究发现DNMTs的异常激活与多种人类恶性肿瘤的发生、发展密切相关,其中包括胰腺癌。DNMTs的异常激活与胰腺癌之间的密切关系提示,它可能成为胰腺癌基因治疗的新靶点。有研究表明多个胰腺癌相关基因的DNA甲基化与DNMT1蛋白表达相关,同时发现在胰腺导管上皮内瘤变向进展期胰腺癌的发展过程中,DNMT1起了非常重要的作用。靶向性沉默DNMT1基因可以使非小细胞肺癌和乳腺癌等细胞的多个抑癌基因去甲基化,同时伴有这些抑癌基因的重新表达。在结肠癌细胞中靶向性沉默DNMT1和DNMT3b基因的表达可以引起细胞总体甲基化水平下降95%,引起多个抑癌基因的重新表达,有效抑制了结肠癌细胞的生长。理论上,阻断DNMT1活性将会使抑癌基因启动子CpG岛去甲基化,促进抑癌基因的表达。因此,它极有可能成为胰腺癌基因治疗的新靶点。近几年来,RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术由于可以高效、特异地抑制目的基因的表达,在肿瘤靶向治疗中展示出了其不可比拟的优势,具有巨大的潜在应用价值。目前基于RNAi技术的肿瘤靶向基因治疗蓬勃发展并已取得了不斐的成绩。基于上述研究现状,本课题将DNMT1作为研究切入点,首先,研究DNMT1在胰腺癌中的表达情况及其与临床和病理的相关性,评价其在胰腺癌中患病风险评估及早期诊断中的价值;其次,利用RNA干扰技术沉默DNMT1基因,观察其对胰腺癌细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响;第三,检测沉默DNMT1基因对胰腺癌细胞DNMT酶活性和DNA甲基化的影响,深入探讨DNMT1 siRNA干扰抗肿瘤的分子机制。本研究包括五部分内容,分述如下。一、人胰腺癌组织中DNMTs基因的表达目的:检测在正常胰腺组织、胰腺癌组织和相应癌旁组织中DNMTs基因mRNA的表达情况,探讨DNMTs在胰腺癌发病机制中的作用。方法:收集22例手术切除的胰腺癌组织及相应癌旁组织和5例正常胰腺组织,采用Real-time RT-PCR法（SYBR GREEN法）检测上述来源组织中DNMTs（包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b）基因mRNA的表达情况。结果:以正常胰腺组织为对照,22例胰腺癌组织和癌旁组织中DNMT1 mRNA的相对表达量分别为2.32（1.17-5.17）和0.78（0.07-3.14）,癌组织中表达明显高于癌旁组织（P=0.024）;胰腺癌组织和癌旁组织中DNMT3a mRNA的相对表达量分别为9.41（0.38-41.95）和2.00（0.22-24.88）,癌组织中表达明显高于癌旁组织（P=0.022）;胰腺癌组织和癌旁组织中DNMT3b mRNA的相对表达量分别为7.78（0.36-43.78）和4.23（0.12-18.51）,癌组织中表达明显高于癌旁组织（P=0.025）。结论:胰腺癌组织中DNMT1,DNMT3a和DNMT3b mRNA的表达明显高于癌旁组织,表明DNMTs基因的异常激活可能在胰腺癌的发生、发展中起重要的作用。二、人胰腺癌组织中DNMT1蛋白表达与临床和病理的相关性研究目的:检测DNMT1蛋白在人胰腺癌组织和相应癌旁组织中的表达情况,分析胰腺癌及癌旁组织中DNMT1蛋白表达水平与临床和病理的相关性。方法:收集2006年1月～2008年3月长海医院手术切除的30例胰腺癌患者的胰腺癌组织和相应癌旁组织,同时收集患者临床资料。所有病例均经病理确诊为胰腺导管腺癌。采用链霉素抗生物素-过氧化酶（streptavidin peroxidase,SP）免疫组织化学法检测胰腺癌和相应癌旁组织中DNMT1蛋白表达。胞核染色判定为阳性。每张切片在高倍镜视野下,随机计数至少500个细胞,计算阳性细胞数占总细胞数的百分率,无肿瘤细胞核着色者为阴性。结果:DNMT1在胰腺导管细胞癌细胞核染色,阳性细胞为棕黄色。在非肿瘤细胞中偶见阳性细胞。胰腺癌中DNMT1表达阳性率54.5%±21.2%,癌旁组织表达阳性率为10.9%±15.0%,有显著性差异（P＜0.01）。根据肿瘤细胞中阳性率是否高于平均值,分为高表达组（19例）和低表达组（11例）。分析DNMT1蛋白表达强度与临床病理参数的关系,结果提示DNMT1表达强度和临床分期（x2=6.897,P=0.029）、淋巴结转移（x2=4.739,P=0.029）、神经浸润与否（x2=5.44,P=0.020）相关,而与年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤大小、肿瘤分化、血清CEA和CA199浓度无关。结论:DNMT1蛋白在胰腺癌组织中表达明显较胰腺癌旁组织高,胰腺癌组织中DNMT1高表达在胰腺癌的侵袭力、淋巴结转移和神经浸润中起到重要的作用。三、DNMT1 siRNA对胰腺癌细胞DNA甲基化的影响目的:检测DNMT1 siRNA干扰对胰腺癌细胞株DNMT酶活性的作用,明确DNMT1 siRNA对胰腺癌细胞株DNA甲基化水平的影响。方法:采用脂质体法DNMT1 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞株。实验分为空白对照组、阴性siRNA（15nM）组、阴性siRNA（30nM）组、DNMT1（15nM）组和DNMT1 siRNA（30nM）组。转染48h后收集细胞,抽提总RNA和蛋白质。采用Real-time RT-PCR和Western-blot法分别检测各组细胞DNMT1基因和蛋白表达的变化,评价DNMT1 siRNA干扰的沉默效率;采用DNMT酶活性检测试剂盒检测DNMT1 siRNA瞬时转染对细胞DNMT酶活性的影响:转染48h后提取各组细胞DNA,并进行亚硫酸盐处理。针对hMLH1和RAR-β基因进行亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）。回收纯化目的产物,将其分别连接pMD18-T载体,氯化钙法转化感受态大肠杆菌,在含氨苄青霉素的LB平板培养进行蓝白斑筛选。对挑选的菌落进行PCR鉴定后摇菌,菌液送检测序,计算其启动子甲基化位点的变化情况。结果:Real-time RT-PCR检测显示DNMT1 siRNA（15nM）组（RQ=0.573±0.026）和DNMT1 siRNA（30nM）组（RQ=0.143±0.044）DNMT1 mRNA表达量显著低于空白对照组（RQ=1.020±0.217）、阴性siRNA组（15nM）（RQ=0.900±0.475）和阴性siRNA组（30nM）（RQ=0.938±0.327）（均P＜0.01）;Western-blot检测显示DNMT1siRNA组（15nM）和DNMT1 siRNA组中DNMT1蛋白的表达低于其他各组:DNMT酶活性检测显示瞬时转染DNMT1 siRNA后DNMT1 siRNA组（15nM）和DNMT1siRNA（30nM）组DNMT1活性显著低于其它各组（P＜0.05）:胰腺癌PaTu8988细胞瞬时转染DNMT1 siRNA后hMLH1和RAR-β基因启动子甲基化率低于空白对照组,有显著性差异（P＜0.05）。结论:DNMT1 siRNA能特异性、高效抑制胰腺癌细胞DNMT1 mRNA及蛋白的表达;DNMT1 siRNA干扰能显著降低胰腺癌PaTu8988细胞DNMT酶活性,并能使胰腺癌细胞hMLH1和RAR-β基因启动子部分去甲基化。四、DNMT1 siRNA对胰腺癌细胞增殖和细胞周期的影响目的:探讨DNMT1 siRNA靶向性沉默DNMT1基因对人胰腺癌细胞增殖、细胞周期及其相关基因CDKN1A mRNA的影响,明确DNMT1 siRNA对胰腺癌细胞的抗肿瘤作用。方法:采用脂质体法DNMT1 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞。采用WST-8法测定各组胰腺癌细胞的增殖情况;应用流式细胞技术检测DNMT1 siRNA干扰对胰腺癌细胞周期的影响;采用Real-time RT-PCR检测DNMT1 siRNA干扰对细胞周期相关基因CDKN1A mRNA水平的影响。结果:WST-8法检测显示siRNA干扰48h后,阴性siRNA（15nM）组、阴性siRNA（30nM）组、DNMT1 siRNA（15nM）组和DNMT1 siRNA（30nM）组的细胞存活率分别为86.3%±8.2%,76.6%±7.3%,82.9%±5.8%和63.1%±14.2%,均低于空白对照组的100%±12.0%（P＜0.01）;DNMT1 siRNA（30nM）组的细胞存活率明显低于空白对照组、阴性siRNA（15nM）组和阴性siRNA（30nM）组、DNMT1 siRNA（15nM组）（P＜0.05）;流式细胞术检测显示DNMT1 siRNA（15nM）组和DNMT1siRNA（30nM）组均出现G2/M期细胞百分率显著低于空白对照组、阴性siRNA（15nM）组和阴性siRNA（30nM）组（均P＜0.05）。siRNA干扰后,DNMT1 siRNA（30nM）组CDKN1A基因mRNA相对表达量（RQ=54.918±5.774）明显高于空白对照组（RQ=1.050±0.363）、阴性siRNA（15nM）组（RQ=5.185±0.165）、阴性siRNA（30nM）组（RQ=7.352±0.074）和DNMT1 siRNA（30nM）组（RQ=5.761±0.271）（均P＜0.05）。结论:转染DNMT1 siRNA能诱导胰腺癌细胞G2/M期细胞周期阻滞,抑制胰腺癌细胞的增殖;同时,上调了细胞周期相关基因CDKN1A mRNA的表达。五、DNMT1 siRNA对胰腺癌细胞凋亡及相关基因的影响目的:探讨DNMT1 siRNA靶向性沉默DNMT1基因对人胰腺癌细胞凋亡及其相关基因Bel-2和Bax mRNA表达的影响,明确DNMT1 siRNA对胰腺癌细胞凋亡影响的分子机制。方法:采用脂质体法DNMT1 siRNA瞬时转染人胰腺癌PaTu8988细胞。采用流式细胞技术检测DNMT1 siRNA干扰对胰腺癌细胞凋亡的影响;采用Real-time RT-PCR检测DNMT1 siRNA干扰对抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax mRNA水平的影响。结果:流式细胞术检测显示空白对照组、阴性siRNA（15nM）组、阴性siRNA（30nM）组和DNMT1（15nM）组细胞凋亡率分别为7.51%±1.12%、9.45%±0.98%、8.84%±1.44%和10.01%±0.66%,各组间无显著性差异。DNMT1 siRNA组的凋亡率为14.94%±2.89%,较其他各组明显升高,有统计学差异（P＜0.01）;siRNA干扰48h后,空白对照组、阴性siRNA（15nM）组、阴性siRNA（30nM）组、DNMT1 siRNA组（15nM）和DNMT1 siRNA组（30nM）的抗凋亡基因Bcl-2 mRNA相对表达量（RQ）依次为1.004±0.108,0.817±0.074,0.672±0.016,0.522±0.050,1.143±0.386,各组间无显著性差异;DNMT1 siRNA组促凋亡基因Bax mRNA相对表达量（RQ=8.000±0.579）明显高于空白对照组（RQ=1.021±0.219）、阴性siRNA（15nM）组（RQ=1.372±0.199）、阴性siRNA（30nM）（RQ=2.636±0.387）和DNMT1 siRNA组（15nM）（RQ=1.316±0.116）（P＜0.05）。结论:转染DNMT1 siRNA能够诱导胰腺癌细胞凋亡增加,其机制可能是通过上调促凋亡基因Bax的表达。通过上述研究,本课题得出以下结论:1、胰腺癌组织中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA较胰腺癌癌旁组织表达高。2、DNMT1蛋白在胰腺癌组织表达明显高于癌旁组织,胰腺癌组织中DNMT1高表达与胰腺癌的侵袭力、淋巴结转移和神经浸润相关。3、DNMT1 siRNA干扰能显著降低胰腺癌细胞的DNMT酶活性,并能使胰腺癌细胞hMLH1和RAR-β基因启动子CpG岛部分去甲基化。4、DNMT1 siRNA干扰抑制了胰腺癌细胞的生长,促使胰腺癌细胞出现G2/M期细胞周期阻滞,上调了细胞周期相关基因CDKN1A的表达。5、DNMT1 siRNA干扰能够诱导胰腺癌细胞凋亡增加,其机制可能是通过上调促凋亡基因Bax的表达。全文总结:DNMT家族在胰腺癌的发生、发展中具有重要的作用。其中,DNMT1的活性与多种胰腺癌相关的基因高甲基化相关。通过干扰DNMT1的表达可对胰腺癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期产生显著的影响。本实验结果为DNMT1成为胰腺癌靶向治疗的新靶点奠定了实验基础。DNMT家族其它成员的作用需要在后续研究中进一步明确。