论文摘要
目的研究建立一种较常规的简单、快速、敏感、特异检测军团菌的方法。方法微孔板液相杂交法检测原理是:用一对生物素标记的上游引物和未标记的下游引物对军团菌16SrRNA的一段DNA进行PCR 扩增,使扩增产物的一条链上带有生物素,PCR 产物变性后,通过固相包被的链霉亲和素进行捕获,探针与生物素标记的扩增产物形成特异的杂交体,然后用标记有辣根过氧化物酶的地高辛抗体与杂交体的上地高辛结合,漂洗后加底物显色,测定吸光度值(A492nm)。对微孔板液相杂交法反应体系进行优化。结果1、电泳结果表明,14 株军团菌均扩增出有效片段,约386bp。2、军团菌特异探针可有效检测14 株军团菌扩增产物3、优化结果表明,最佳链霉亲和素包被浓度为5μg/mL、地高辛标记探针浓度为3pmol/次、酶标记抗地高辛抗体浓度为1:1000,确定杂交时间为60min,杂交温度37℃为最佳。4、琼脂糖电泳可检测190fg 军团菌DNA 模板,微孔板液相杂交可检测19fg 军团菌DNA 模板,显示微孔板液相杂交法灵敏度较电泳法高十倍。5、电泳和微孔板液相杂交特异性均较高。6、微孔板液相杂交法重复性良好。结论微孔板液相杂交法检测军团菌具有较好的灵敏性、特异性、重复性,有望成为早期、快速诊断军团菌感染的有效方法。
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