四君子汤对烟曲霉菌生长和毒性代谢的抑制作用以及相关分子机制的研究

论文摘要

目的：观察四君子汤对烟曲霉菌体外生长繁殖和毒性代谢产物的抑制作用；对孢子萌芽相关基因（pkaC1）表达调节的影响；以及对感染小鼠的烟曲霉菌生长与致炎症反应的抑制作用。方法：1四君子汤对烟曲霉菌体外生长的抑制作用：不同剂量的四君子汤和氟康唑处理的103个烟曲霉菌孢子均匀涂布在沙氏固体培养基,培养4d,计算并比较烟曲霉菌生长形成的菌落数量、菌落大小、镜下计数孢子柄与孢子的数量。2四君子汤对烟曲霉菌毒性代谢产物的抑制作用2.1四君子汤处理的孢子培养滤液的细胞毒性试验：将不同剂量中药处理的孢子培养滤液对倍稀释,与103个HeLa细胞于37℃5% CO2培养箱培养48h,台盼蓝染色法计算各孔活细胞数。计数每组的细胞存活率%与观察抑制50%细胞生长的滤液稀释度。2.2四君子汤处理的孢子培养滤液溶解红细胞试验：将不同中药组处理的孢子培养滤液各900μL分别与100μL 104鸡红细胞于EP管内,37℃振荡培养24h,每组设5管,计数各组的红细胞平均存活率。2.3四君子汤对过氧化氢杀烟曲霉菌孢子的影响:将2x106孢子与20 mL沙氏固体培养基混匀倒板,培养基中间打直径约为1cm小孔,分别加入不同剂量中药和生理盐水,置37℃,使药液充分扩散与孢子作用1h后。小孔内加100μL0.3%的H2O2,37℃培养48h后,测量抑菌圈直径大小并计算其均数。3 RT-PCR测定pkaC1基因的表达：不同剂量的中药作用孢子1h,提取孢子总RNA,RT-PCR检测各个组孢子pkaCl和actin基因的表达。琼脂糖凝胶电泳,扫描测定PCR产物条带的灰度密度值,每组以pkaC1和actin灰度密度值的比值作为目的基因pkaCl相对表达量。4四君子汤对感染小鼠干预效果观察：小鼠感染烟曲霉菌后,连续4d服用不同剂量的中药,无菌法分离肺组织用于：1)制作病理切片以观察各组小鼠肺组织的病理反应,炎症细胞浸润；2)组织研碎接种沙氏培养基,37℃培养4天,计算菌落数,以观察各组小鼠肺组织真菌的荷载。结果：1四君子汤对烟曲霉菌体外生长的抑制作用：与对照组相比,四君子汤和氟康唑可以显著降低烟曲霉菌的菌落数量和菌落大小,抑制孢子柄与孢子的的形成（P<0.05）,结果呈现剂量-效应关系。与氟康唑处理组相比,300μL四君子汤处理的分生孢子形成的菌落数、菌落大小和孢子柄和产生的分生孢子数均显著低于氟康唑处理组（P<0.05）。2四君子汤对烟曲霉菌毒性代谢产物的抑制作用：四君子汤处理的烟曲霉菌孢子培养液滤液作用的HeLa细胞和红细胞生存率显著高于无药物处理组（P<0.05）,抑制50%细胞的药物组孢子培养液滤液的稀释度低于无药物组,结果均呈现剂量-效应关系；100μtL 0.3% H2O2在沙氏固体培养板上作用一定剂量四君子汤处理的烟曲霉菌孢子所产生抑菌圈直径显著大于无药物处理组（P<0.05）,结果呈现剂量一效应关系。说明四君子汤可以降解烟曲霉菌毒性代谢产物与触酶的产生3 RT-PCR测定pkaCl基因的表达：四君子汤处理的孢子细胞内pkaC 1基因表达显著低于无中药组（P<0.05）,随着中药的剂量加大,孢子细胞中mRNA表达逐步下调,呈现剂量-效应关系（P<0.05）。4四君子汤对感染小鼠干预效果观察：四君子汤治疗组与未服药组相比肺组织菌落数较少,色素减弱,病理改变较轻；肺组织的烟曲霉菌培养结果显示,中药治疗组小鼠肺组织烟曲霉菌荷载显著低于未治疗药组（P<0.05）。结论：1.中药方剂四君子汤可以抑制烟曲霉菌的体外生长和毒性代谢产物的产生,在治疗烟曲霉菌所致的肺部感染具有潜在的应用价值。2.中药方剂四君子汤作用烟曲霉孢子后能下调cAMP-PKA信号转导途径中的pkaCl基因的表达,可能是抑制其生长代谢的一种机制。3.四君子汤对感染小鼠的烟曲霉菌生长繁殖有一定的抑制作用,为临床预防与治疗烟曲霉菌所致的肺部感染积累了一定实验数据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 实验药物、试剂
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 四君子汤对烟曲霉菌生长的影响
• 2.2.2 四君子汤对烟曲霉菌毒性代谢产物的抑制作用
• 2.2.3 RT-PCR测定pkaCl基因的表达
• 2.2.4 四君子汤对烟曲霉菌感染小鼠的干预效果
• 2.2.5 数据统计分析
• 第3章 结果
• 3.1 四君子汤对烟曲霉菌体外生长的抑制作用
• 3.1.1 四君子汤对烟曲霉菌菌落的影响
• 3.1.2 四君子汤对烟曲霉菌孢子数的影响
• 3.1.3 四君子汤对烟曲霉菌孢子柄形成的影响
• 3.2 四君子汤对烟曲霉菌毒性代谢产物的抑制作用
• 3.2.1 四君子汤处理的孢子培养滤液的细胞毒性试验
• 3.2.2 四君子汤处理的孢子培养滤液溶红细胞试验
• 3.2.3 四君子汤对过氧化氢杀烟曲霉菌孢子的影响
• 3.3 四君子汤对烟曲霉菌孢子PKAC1的表达影响
• 3.4 小鼠的感染治疗与病理变化观察
• 3.4.1 四君子汤对感染小鼠肺组织病理变化的影响
• 3.4.2 小鼠肺组织烟曲霉菌计数
• 第4章 讨论
• 第5章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附图
• 攻读学位期间的研究成果
• 综述
• 参考文献