基于分子信标及生物条码技术的生物传感器检测端粒酶及肿瘤细胞

论文摘要

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病,对肿瘤标志物和肿瘤细胞进行准确而灵敏的检测,对于了解疾病的形成过程和机制,及其的诊断、预防和治疗有着极其重要的意义。本论文主要利用分子信标及纳米粒子的特性构建了新型的生物传感器,其中应用了生物条码技术、纳米金粒子的放大技术和室温下链置换循环放大技术,并且将此传感器应用在端粒酶和肿瘤细胞的分析检测当中,取得了较理想的结果。本论文的主要内容包括以下三个部分:1.基于分子信标的特性,设计了一种新颖的检测高纯化端粒酶的方法,此方法不需要PCR过程及放射性物质。实验中采用荧光探针做为TS前体延伸的模板及信号的携带者。探针与端粒酶作用后的DNA链杂交后,茎环结构打开,荧光信号增强,构建出一种高灵敏检测端粒酶的生物传感器,该方法的灵敏度是非常显著的。检测范围从2.5×10-15gmL-1-2.5×10-12 gmL-1。另外,由于端粒酶特性催化,该体系对目标物具有很高的选择性,其他类型的酶对端粒酶的检测干扰很小,而且可以应用于实际样品的检测中,故该体系能为临床医学和生物分析提供了一种新的分析方法。2.基于分子探针所独有的优越性及链置换循环反应的信号放大作用,本方法采用了一种荧光探针、两个前体经过端粒酶扩链和链置换循环反应后实现了端粒酶活性的检测,端粒酶提取液的浓度检测范围为4-1000个细胞,相当于4个HeLa细胞中端粒酶的浓度,所以本方法可直接应用于端粒酶及肿瘤细胞的检测。此方法仅需要一些探针、dNTPs、酶,较其他方法,成本较低,操作简便,其不仅可以作为检测端粒酶及肿瘤细胞的方法,还可用于检测其他肿瘤标志物,就有广泛的应用前景。3.基于新型标记物巯基二茂铁和纳米金粒子设计了一种直接检测的电化学传感器。首先在电极上组装了一个三明治结构,包括作为固载在金电极上的捕获DNA、待测RNA以及标记有FeC和信号DNA的AuNPs。DPV电化学信号的强弱与巯基二茂铁的量成正比,巯基二茂铁的量与待测RNA的浓度相关,RNA的浓度又能间接的反映HeLa细胞的数目,从而构成了检测HeLa细胞的电化学传感器,其具有很好的检测灵敏度。另外,由于采用了特定的RNA序列,该体系对目标物具有很高的选择性,这种检测方法对肿瘤细胞HeLa具有很高的特异性识别能力,其检测的线性范围是1.0×10-15-1.0×10-13 M,100-2000cells,检测限为4.2×10-16M,76cells,经过研究发现,此检测方法操作简单,实用性强,检测速度快,选择性高,因此具有广阔的应用前景。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 前言
• 1.1 生物传感器
• 1.1.1 生物传感器的概念、组成及分类
• 1.1.2 生物传感器的工作原理
• 1.1.3 生物传感器的特点
• 1.1.4 DNA 生物传感器
• 1.1.4.1 DNA 生物传感器的工作原理
• 1.1.4.2 单链DNA 在电极表面的固定
• 1.1.5 细胞传感器
• 1.1.5.1 细胞传感器的定义
• 1.1.5.2 细胞传感器的分类
• 1.2 纳米材料
• 1.2.1 纳米材料的定义
• 1.2.2 纳米材料的特性
• 1.2.3 纳米材料的制备和修饰
• 1.2.4 纳米探针及其分类
• 1.2.4.1 半导体纳米粒子探针
• 1.2.4.2 金属纳米粒子探针
• 1.2.4.3 复合型纳米粒子探针
• 1.2.4.4 磁性纳米粒子探针
• 1.3 肿瘤细胞及肿瘤标志物
• 1.3.1 肿瘤细胞及其特征
• 1.3.2 肿瘤标志物及其分类
• 1.3.3 端粒及端粒酶
• 1.3.3.1 端粒的发现及研究
• 1.3.3.2 端粒酶的发现及研究
• 1.3.3.3 端粒酶与肿瘤细胞的关系
• 1.3.3.4 端粒酶的检测方法
• 1.4 分子信标
• 1.4.1 分子信标的定义及工作原理
• 1.4.2 分子信标的应用
• 1.4.2.1 应用于核酸检测
• 1.4.2.2 应用于活细胞的检测
• 1.5 RNA
• 1.5.1 RNA 的组成
• 1.5.2 RNA 的种类和作用
• 1.5.2.1 mRNA 的定义及其作用
• 1.5.2.2 tRNA 及rRNA
• 1.5.2.3 RNA 在肿瘤细胞检测中的作用
• 1.6 课题意义及主要内容
• 参考文献
• 第2章 基于分子信标肿瘤细胞中端粒酶活性的检测
• 2.1 引言
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 仪器与试剂
• 2.2.1.1 试剂
• 2.2.1.2 仪器
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 DEPC 水的配制及EP 管的处理
• 2.2.2.2 端粒酶扩链溶液的配制
• 2.2.2.3 端粒酶的扩链反应
• 2.2.2.4 荧光测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 原理示意图
• 2.3.2 实验可行性
• 2.3.3 实验条件的优化
• 2.2.3.1 扩链反应缓冲溶液的选择
• 2.2.3.2 缓冲溶液pH 的选择
• 2.2.3.3 端粒酶反应温度的选择
• 2.2.3.4 前体浓度的选择
• 2.3.4 标准端粒酶活性的检测
• 2.3.5 方法的重现性与稳定性
• 2.4 小结
• 参考文献
• 第3章 基于室温下链置换循环放大反应的肿瘤细胞中端粒酶活性的荧光检测
• 3.1 引言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 仪器与试剂
• 3.2.1.1 试剂
• 3.2.1.2 仪器
• 3.2.2 实验方法
• 3.2.2.1 细胞培养
• 3.2.2.2 从HeLa 细胞中提取端粒酶
• 3.2.2.3 端粒酶的扩链反应
• 3.2.2.4 室温下链置换循环反应
• 3.2.2.5 荧光检测
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 端粒酶活性检测的原理
• 3.3.2 检测方法的可行性
• 3.3.3 实验条件的优化
• 3.3.3.1 端粒酶反应条件的优化
• 3.3.3.2 循环条件的优化
• 3.3.4 标准端粒酶的检测
• 3.3.5 HeLa 细胞中端粒酶活性的检测
• 3.3.6 各方法灵敏度的比较
• 3.4 小结
• 参考文献
• 第4章 基于生物条码技术的HeLa 细胞mRNA 的电化学生物传感器
• 4.1 引言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 仪器与试剂
• 4.2.1.1 试剂
• 4.2.1.2 仪器
• 4.2.2 实验方法
• 4.2.2.1 细胞培养
• 4.2.2.2 HeLa 细胞中RNA 的提取
• 4.2.2.3 Au 纳米粒子的制备
• 4.2.2.4 Au NPs 上巯基二茂铁（FeC）和信号DNA 的修饰
• 4.2.2.5 电极的处理及捕获DNA 的固定
• 4.2.2.6 不同浓度的HeLa 细胞的测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 传感器的组装及检测原理
• 4.3.2 实验条件的优化
• 4.3.2.1 巯基二茂铁（FeC）和信号DNA 比例条件的优化
• 4.3.2.2 纳米探针捕获时间的优化
• 4.3.3 纳米探针信号放大的可行性
• 4.3.4 Au NPs 探针的紫外光谱表征
• 4.3.5 传感器组装的表征
• 4.3.6 合成RNA 的检测
• 4.3.7 HeLa 细胞中RNA 的检测
• 4.4 小结
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文目录