促酰化蛋白对3T3-L1脂肪细胞中脂滴相关蛋白表达的影响及其信号机制的研究

论文摘要

第一部分促酰化蛋白对3T3-L1脂肪细胞分化进程中脂滴相关蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表达的影响研究背景：随着研究深入，脂肪组织为一个活跃内分泌器官的观念，已被大多数学者所接受。越来越多的研究表明，脂肪细胞可以产生多种特异性或非特异性的脂肪因子（adipocytokine），如促酰化蛋白（acylationg stimulating protein，ASP）、脂联素（adiponectin）、抵抗素（resistin）、瘦素（leptin）、腔脂素（visfatin）等，这些因子通过内分泌、旁分泌或自分泌的生物学作用方式，在调节糖、脂代谢及维持能量平衡中发挥重要作用。ASP是一种来源于补体系统的脂肪因子，目前关于ASP的研究主要集中在调节糖、脂代谢方面。ASP的生物学作用包括：刺激脂肪细胞甘油三酯合成（TGS）、葡萄糖转运并抑制脂肪分解。ASP具备与胰岛素相互叠加而又相对独立的生物学效应。ASP对餐后甘油三酯（TG）的清除具有重要作用。肥胖及其相关代谢紊乱性疾病包括2型糖尿病、冠心病、高血压等，血浆ASP水平升高，且与体重指数、血脂密切相关；而体重下降和运动锻炼可使升高的血浆ASP明显下降。脂滴（Lipiddroplets）又称脂肪小体，是脂肪细胞储存TG的亚细胞结构。近年来脂滴相关蛋白（lipiddroplets associated protein）的发现，使人们认识到脂滴不仅是能量的储存库，还是活跃的脂质代谢池，是具有独立功能的细胞器，参与胞内运输和脂质代谢。Perilipin、adipophilin、TIP47作为PAT家族蛋白的重要成员，不仅仅在脂滴的快速合成、新生脂滴的稳定、脂滴的成熟以及脂滴在细胞内的转位中发挥作用，还参与了多种病理过程的发生和发展，脂滴的过度异位沉积于巨噬细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞内，将使其转化为泡沫细胞，是形成动脉粥样硬化斑块的初始环节。目的：本文旨在通过观察分化过程中促酰化蛋白（acylation stimulating protein，ASP）对脂滴相关蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表达的影响，探讨adipophilin、perilipin和TIP47在介导ASP促成脂过程中的作用。方法：体外培养小鼠来源的3T3-L1前脂肪细胞，经典激素鸡尾酒法诱导分化，根据实验室前期工作验证的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的时序性变化规律选取几个代表性的作用时间点，设立ASP（1μmol／L）刺激组、胰岛素（100 nmol／L）刺激组及空白对照组：（1）[3H]油酸掺入法测定不同刺激状态下脂肪细胞甘油三酯合成率；（2）[3H]-2-脱氧葡萄糖（[3H]-2-DG）掺入法测定不同刺激状态下脂肪细胞葡萄糖转运率；（3）RT-PCR方法检测adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表达；（4）Western blot方法检测adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表达结果：（1）脂肪细胞分化第3天和第6天，ASP组甘油三酯合成率显著高于空白对照组（P＜0．05，P＜0．01），胰岛素组各检测时间点甘油三酯合成率与正常对照组无显著性差异；（2）脂肪细胞分化第6天和第9天，ASP组和胰岛素组葡萄糖转运率均较同期空白对照组显著增加（P＜0．05，P＜0．01），其增加效应，胰岛素组较ASP组更为显著（P＜0．05，P＜0．001）；（3）与空白对照组相比，ASP组adipophilin基因和蛋白表达水平从0天起显著升高（P＜0．05，P＜0．001），第4天以后无显著统计学差异，ASP组perilipin基因和蛋白表达水平从第3天起显著升高（P＜0．05，P＜0．001），直至完全分化成熟（第9天），仍显著高于同期正常组（P＜0．05），ASP组TIP47基因和蛋白表达有显著的上调作用，但随着分化至48h此上调作用已不明显；（4）胰岛素组adipophilin和perilipin基因和蛋白表达水平均与同期对照组相比无显著统计学差异，胰岛素仅在分化的0d对脂肪细胞中TIP47 mRNA和蛋白表达有上调作用，之后基本无影响。结论：ASP组adipophilin、perilipin和TIP47的表达与脂肪细胞分化过程中ASP促进甘油三酯合成之间具有显著相关性，ASP可能通过调节adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白的表达影响脂肪细胞内脂质聚积和脂滴形成。第二部分PLC信号途径参与促酰化蛋白调节脂滴相关蛋白的基因／蛋白表达背景：磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）为磷脂酰肌醇信号通路的关键酶，在机体内分布极广。诸多细胞外信息分子，如激素、免疫球蛋白、神经递质、生长因子、细胞因子等，均可激活磷脂酰肌醇特异性PLC。活化的PLC水解磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），产生两种重要的第二信使：二酯酰甘油（DAG）和三磷酸肌醇（IP3），进而将细胞外的信息传递给下游的效应分子，调节细胞的生命活动。近期ASP功能性受体C5L2的发现、纯化和鉴定，将ASP在脂代谢领域的研究又大大推进，并证实PLC途径是ASP／C5L2的重要信号通路。目的：本文旨在观察阻断细胞PLC信号途径后，促酰化蛋白（acylation stimulating protein，ASP）对脂滴相关蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表达影响的变化，探讨ASP对脂滴相关蛋白adipophilin、perilipin和TIP47的调控是否有PLC信号机制的参与。方法：体外培养小鼠来源的3T3-L1前脂肪细胞，经典激素鸡尾酒法诱导分化，根据实验室前期工作验证的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的时序性变化规律选取几个代表性的作用时间点，设立ASP（1μmol／L）刺激组、U73122（5μmol／L）处理组、U73122（5μmol／L）预处理+ASP（1μmol／L）刺激组及空白对照组：（1）RT-PCR方法检测adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表达变化：（2）Western blot方法检测adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表达变化结果：（1）PLC信号途径阻断剂U73122对3T3-L1脂肪细胞分化特定时期内adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白表达有显著的下调作用：①与同期正常对照组相比，U73122干预组adipophilin mRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均显著下降（P＜0．05，P＜0．01，P＜0．001）adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，第3天和第4天显著下调（P＜0．05）；②与同期正常对照组相比，U73122干预组perilipin mRNA水平在分化起始点时稍下降，但无统计学意义（P＞0．05），分化第3天，第6天和第9天均明显下调（P＜0．05）：perilipin蛋白水平于分化第3天，第4天，第6天和第9天分别下降（P＜0．05，P＜0．01）；③与同期正常对照组相比，U73122干预组TIP47 mRNA及蛋白水平于分化第0天，第12小时，第1天和第2天均明显下调（P＜0．05，P＜0．01）（2）U73122能显著抑制ASP对adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上调效应，但并不能完全阻断上述效应。①与单一ASP刺激组相比，U73122预处理后加ASP刺激组adipophilinmRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均显著下降（P＜0．05，P＜0．01）：adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，第3天和第4天和第6天均显著下调（P＜0．05）；②与单一ASP刺激组相比，U73122预处理后加ASP刺激组perilipinmRNA水平于分化第3天，第6天和第9天显著下调（P＜0．05，P＜0．01）；perilipin蛋白水平仅在分化第4～6天时明显下调（P＜0．05），其它时点均无显著统计学差异；③与单一ASP刺激组相比，U73122预处理后加ASP刺激组TIP47mRNA水平TIP47 mRNA及蛋白水平于分化第0天，第12小时，第1天和第2天均明显下调（P＜0．05，P＜0．01）结论：PLC信号途径参与介导ASP对adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上调效应，但并非其唯一信号机制。第三部分PI3K信号途径参与促酰化蛋白调节脂滴相关蛋白的基因／蛋白表达背景：磷酯酰肌醇3激酶（phosphoinositide-3-kinase，PI3K）家族，为生长因子超家族信号转导过程中的重要分子，能被多种细胞因子和理化因素激活，是一类特异性催化磷酯酰肌醇（phos-phatidylinositol，PI）的3位羟基磷酸化，并产生具有第二信使作用的肌醇脂物质的激酶，在细胞周期调控、细胞生长凋亡及细胞代谢等多种生物学过程中发挥重要作用。Wortmannin是一种霉菌的代谢产物，也是PI3K特异性的抑制剂，最初由Penicillium-wortmannii分离得到，能够不可逆性地抑制PI3K的活性。有研究报道，PI3K抑制剂wortmannin和LY294002（两者均阻止脂肪分化）预处理，可阻断细胞内adipophilin的表达。Katherine教授实验室研究证实，PI3K途径是介导ASP／C5L2调控糖、脂代谢的重要信号通路。目的：本文旨在观察阻断细胞PI3K信号途径后，促酰化蛋白（acylation stimulatingprotein，ASP）对脂滴相关蛋白adipophilin、perilipin和TIP47表达影响的变化，利用PI3K特异性抑制剂wortmannin了解PI3K在ASP对脂滴相关蛋白adipophilin、perilipin和TIP47调控中所起的作用。方法：体外培养小鼠来源的3T3-L1前脂肪细胞，经典激素鸡尾酒法诱导分化，根据实验室前期工作验证的adipophilin、perilipin和TIP47基因和蛋白水平的时序性变化规律选取几个代表性的作用时间点，设立ASP（1μmol／L）刺激组、wortmannin（100nmol／L）处理组、wortmannin（100nmol／L）预处理+ASP（1μmol／L）刺激组及空白对照组：（1）RT-PCR方法检测adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA表达变化；（2）Western blot方法检测adipophilin、perilipin和TIP47蛋白表达变化结果：（1）PI3K信号途径阻断剂wortmannin对3T3-L1脂肪细胞分化特定时期内adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白表达有显著的下调作用：①与同期正常对照组相比，wortmannin干预组adipophilin mRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均显著下降（P＜0．01，P＜0．001）adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，第3天和第4天显著下调（P＜0．05，P＜0．01）；②与同期正常对照组相比，wortmannin干预组perilipin mRNA水平在分化第0天，分化第3天，第6天和第9天均明显下调（P＜0．05）：perilipin蛋白水平于分化第3天，第4天，第6天和第9天分别下降（P＜0．05）；③与同期正常对照组相比，wortmannin干预组TIP47 mRNA及蛋白水平于分化第0天，第12小时，第1天和第2天均明显下调（P＜0．05，P＜0．01，P＜0．001）（2）Wortmannin能显著抑制ASP对adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上调效应，但并不能完全阻断上述效应。①与单一ASP刺激组相比，wortmannin预处理后加ASP刺激组adipophilinmRNA水平于分化第0天，第3天，第6天和第9天均显著下降（P＜0．01，P＜0．001）；adipophilin蛋白水平于分化第0天，第1天，第3天，第4天和第6天显著下调（P＜0．05，P＜0．01）；②与单一ASP刺激组相比，wortmannin预处理后加ASP刺激组perilipinmRNA水平于分化第3天，第6天和第9天显著下调（P＜0．05，P＜0．01）；perilipin蛋白水平从分化第4天起明显下调（P＜0．05）；③与单一ASP刺激组相比，wortmannin预处理后加ASP刺激组TIP47mRNA水平及蛋白水平于分化第0天，第12小时，第1天均明显下调（P＜0．05，P＜0．01），两组mRNA水平自分化第2天时无显著统计学差异。结论：PI3K信号途径参与介导ASP对adipophilin、perilipin和TIP47 mRNA和蛋白的上调效应，但并非其唯一信号机制。

论文目录

• 英文缩略词中英文对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 促酰化蛋白对3T3-L1脂肪细胞分化进程中脂滴相关蛋白ADIPOPHILIN、PERILIPIN和TIP47表达的影响
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 PLC信号途径参与促酰化蛋白调节脂滴相关蛋白的基因/蛋白表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 PI3K信号途径参与促酰化蛋白调节脂滴相关蛋白的基因/蛋白表达
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 小结
• 综述
• 附录 攻读学位期间文章发表情况
• 致谢