淹水胁迫下拟南芥和玉米根系中脯氨酰羟化酶基因选择性剪接的初步研究

论文摘要

在可以对全球物种的分布和产量造成影响的非生物逆境胁迫中,涝害和干旱、盐渍、异常温度等同样占据着很大的比例。淹水胁迫的实质伤害主要是氧气的缺乏,而揭示植物是如何感知氧气浓度的下降并传递该信号具有至关重要的作用,因此克隆信号分子是研究植物对淹水应答的关键。然而在植物中尽管有很多这方面的研究,但是始终未克隆到真正的信号传递分子。在动物中关于低氧信号传递的研究甚为明朗,各种研究已经表明脯氨酰羟化酶就是动物中感受和传递低氧信号的关键分子,并且选择性剪接参与了该基因在动物中的厌氧应答。然而该基因在植物中的研究却极少。本研究旨在以模式植物拟南芥和玉米为材料对P4H基因进行分析,为揭示选择性剪接在植物的淹水应答过程中可能起到的调控作用寻求突破口。主要得到的实验结果如下：1.在拟南芥中已有报导P4H基因家族的13个成员可能涉及到厌氧应答的早期调控过程。本研究表明该基因家族中的3个成员涉及到选择性剪接,分别为AtP4H1,AtP4H7和AtP4H13.选择性剪接产生了4个选择性剪接转录本,各命名为AtP4H1-2,AtP4H1-3, AtP4H7-1以及AtP4H13-1。这表明在植物中对于P4H基因而言,选择性剪接可能是一个非常普遍的现象。各种选择性剪接方式,如内含子的保留、外显子的跳跃以及非组成型剪接位点的选择均给这些选择性剪接转录本引入了提前终止的密码子,这些转录本编码产物均为截短的蛋白质。RT-PCR结果表明在不管是对照还是淹水处理后的拟南芥根系中选择性剪接产生的转录本丰度均极低,在琼脂糖凝胶上几乎不可见,而正常转录本则十分明晰,这可能是因为这些选择性剪接转录本可能遭到降解。2.P4H在玉米耐渍应答中的作用尚未明了,本研究以玉米耐渍自交系HZ32为材料,对zmP4H基因家族进行研究,研究结果表明3个zmP4H基因家族成员发生了mRNA的选择性剪接,产生了17个不同的转录本,其中zmP4H1含有5个转录本,zmP4H2含有6个转录本,zmP4H3含有6个转录本。在不同的自交系之间,即使是同一个基因成员,其mRNA剪接方式也不尽相同。在正常和淹水条件下,HZ32苗期根系中zmP4H基因RT-PCR结果表明,zmP4H家族的各个成员表现出不同的转录模式,同一个zmP4H成员发生选择性剪接的转录本丰度不同,zmP4H基因成员间发生选择性剪接的转录本丰度也各异,这是对玉米耐渍适应性的应答中存在选择性剪接这种转录后调控的首次报导。选择性剪接产生了11个含有提前终止的密码子转录本,这些转录本可能成为NMD（无义密码介导的mRNA降解,Nonsense Mediated mRNA Decay,NMD）降解的目标。虽然zmP4H2-1含有提前终止的密码子,但其表达丰度不管是在对照还是处理情况下均不是很低（但其表达丰度在正常和淹水条件下没有差异）,这表明NMD可能不能够完全地降解含有PTC的转录本,或者该转录本不是NMD的降解目标。然而,在对照和处理的HZ32根系中利用蛋白合成抑制剂放线菌酮（Cycloheximide,CHX）来抑制NMD过程后对zmP4H2-1的扩增结果表明,在CHX阻断NMD作用后该转录本丰度显著增加,表明该转录本为NMD降解的目标。综上所述,在玉米根系的淹水应答过程中,选择性剪接和NMD协同调控P4H基因各转录本的丰度。我们的研究表明玉米在淹水胁迫下转录本的选择性剪接调控zmP4H2-1家族基因的应答,为今后进一步分析P4H基因家族成员的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 前言
• 1 涝害对作物生产的影响
• 2 植物低氧胁迫下的信号传导
• 2.1 氧气
• 2.2 乙烯
• 2.3 血红蛋白
• 2.4 pH
• 2.5 脯氨酰羟化酶基因
• 3 选择性剪接的生物学意义
• 4 无义密码介导的MRNA降解
• 第二章 淹水胁迫下拟南芥P4H基因的选择性剪接
• 1 背景
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 拟南芥根系总RNA提取及RT-PCR分析
• 2.3 PCR扩增及序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA质量检测
• 3.2 AtP4H家族成员的选择性剪接转录本的序列克隆
• 3.3 选择性剪接对AtP4H所编码蛋白质的影响
• 4 讨论
• 第三章 淹水胁迫下玉米P4H基因的选择性剪接以及NMD
• 1 背景
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 玉米根系总RNA抽提及RT-PCR
• 2.3 zmP4H基因mRNA序列及半定量RT-PCR分析
• 3 结果
• 3.1 RNA含量和质量的检测
• 3.2 zmP4H基因家族中的选择性剪接现象
• 3.3 选择性剪接对zmP4H所编码蛋白质的影响
• 3.4 zmP4H基因在HZ32中淹水胁迫下的表达变化
• 3.5 zmP4H的选择性剪接与NMD的关系
• 4. 讨论
• 4.1. P4H基因家族中的选择性剪接
• 4.2. zmP4H在HZ32淹水胁迫下受RUST调控
• 参考文献
• 附录
• 附录1 拟南芥ATP4H1基因的选择性剪接转录本的多序列比对
• 附录2 拟南芥ATP4H7基因的选择性剪接转录本的多序列比对
• 附录3 拟南芥ATP4H13基因的选择性剪接转录本的多序列比对
• 附录4 玉米zMP4H1基因的选择性剪接转录本的多序列比对
• 附录5 玉米ZMP4H2基因的选择性剪接转录本的多序列比对
• 附录6 玉米zMP4H3基因的选择性剪接转录本的多序列比对
• 附录7 常用分子生物学技术及试剂配制
• 发表和已经准备的论文
• 致谢