论文摘要
喜树碱（CPT）是从我国特有植物喜树中提取出来的一种五环生物碱,是一类新型的抗肿瘤药物。TopoⅠ在DNA的复制转录和重组中均起重要作用。喜树碱类化合物因抑制TopoⅠ而形成喜树碱类化合物-TopoⅠ-单链DNA复合体,使肿瘤细胞内功能正常的TopoⅠ转变为导致DNA链断裂的致伤物。此外,还发现喜树碱类化合物具有诱导细胞凋亡的作用。但临床研究表明,喜树碱会产生骨髓抑制、呕吐、腹泻和血尿等严重的副作用。且其水溶性较差,难以制成合适的剂型,也限制了它的临床应用。由于喜树碱类化合物在化学结构上都含有一个末端的内酯环,使得它们在水溶液中呈迅速地、pH依赖性地、非酶作用地水解,形成开环的氢氧和羧酸基团。这个水解过程使得这些喜树碱类化合物对TopoⅠ的作用大大减弱。据此我们合成了7-（3’-哌啶基丙炔基）喜树碱（CPT21）,它是一种通过Sonogashira反应合成的喜树碱7位取代衍生物,且具有较好的水溶性。本文对CPT21的体内外抗肿瘤活性进行了系统的评价,并对其抑制胃癌生长的作用抑制进行了深入的研究。目的:研究CPT21的体内体外抗肿瘤活性,并对其抗肿瘤作用机制进行研究。方法:首先用MTT法测定CPT21对10株不同来源的肿瘤细胞株的体外抑制作用,并分别计算IC50值,以比较体外抑制作用强度;同时采用拓扑异构酶I催化活性检测模型,通过琼脂糖凝胶电泳,检测CPT21对拓扑异构酶Ⅰ活性的体外抑制作用;通过荷SGC-7901移植瘤裸鼠模型评价CPT21的体内抗肿瘤活性;为了深入研究CPT21在体内外抑制肿瘤生长的机制,我们选取了胃癌SGC-7901细胞并使用流式细胞术测定CPT21诱导SGC-7901细胞的凋亡率;为进一步研究CPT21引起细胞凋亡的机制,我们采用JC-1染色法观察经CPT21处理过的SGC-7901细胞中线粒体膜电位（△ψm）的变化,用Westernblot法检测凋亡相关蛋白表达,用caspase活性检测试剂盒测定caspase-3活性的变化;最后,我们还用鸡胚尿囊膜实验模型评价CPT21对新生血管形成的影响。结果:1.CPT21对不同来源的10株肿瘤细胞株都具有显著的体外抑制作用。MTT结果显示,CPT21对人肝癌Bel-7402细胞,人慢性髓性白血病K562细胞,人急性早幼粒白血病HL-60细胞,人雄性激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞,人口腔表皮癌KB细胞,人食道癌ECA-109细胞,人非小细胞肺癌A549细胞,人乳腺癌MCF-7细胞,人脑胶质瘤U251细胞和人胃癌SGC-7901细胞的IC50值分别为3.0±1.7μM,0.13±0.04μM,0.10±0.05μM,0.10±0.08μM,5.0±2.1μM,7.9±3.5μM,7.3±3.5μM,1.3±1.1μM,12.0±4.1μM,6.3±3.1μM。2.CPT21对拓扑异构酶Ⅰ活性具有显著的体外抑制作用,呈一定的量效关系。在200μM剂量下与阳性药物SN38比较,作用强于SN38。3.裸鼠移植瘤模型的实验结果显示,隔2或3天连续给药26天后,CPT2110.0mg/kg剂量组的抑瘤率达到了75.1%,治疗效果好于相同剂量的阳性药物Irinotecan,65.1%。CPT21 5.0 mg/kg剂量组的抑瘤率也达到了42.5%。4.流式细胞术结果表明,CPT21能诱导SGC-7901细胞呈时间和剂量依赖性的凋亡。结果显示,经5.0μM CPT21处理12,24和48小时后,SGC-7901细胞的凋亡率分别为10.2%,13.5%和69.7%。用不同浓度的CPT21（2.5,5.0和10.0μM）处理SGC-7901细胞24小时后,其凋亡率分别为6.2%,13.5%和34.5%。5.CPT21可诱导SGC-7901细胞的线粒体膜电位下降。5.0μM CPT21处理SGC-7901细胞不同时间（12,24和48小时）后,绿色/红色荧光比值从2.9上升到12.3。而用不同浓度CPT21（2.5,5.0和10.0μM）处理SGC-7901细胞24小时后,绿色/红色荧光比值从2.9上升到45.0。证实CPT21能引起线粒体膜电位呈时间和剂量依赖性地下降。6.Western blot结果显示,CPT21促使SGC-7901细胞内PARP降解,procaspase-9和XIAP表达的下调,磷酸化c-Jun NH2-terminal protein kinase（JNK）表达的增加,同时诱导caspase-3活性的增加。CPT21还促使Bax蛋白表达上调和Bcl-2蛋白表达下调,使Bax/Bcl-2比值明显增加。此外,CPT21可诱导SGC-7901细胞内p53蛋白和p21蛋白的表达增加。7.鸡胚尿囊膜实验结果显示,5.0μg/蛋和1.0μg/蛋CPT21明显抑制了新生血管的形成,其中5.0μg/蛋CPT21的抑制作用与5.0μg/蛋阳性对照药物拓扑替康的抑制作用相似。结论:CPT21具有广谱的抗肿瘤活性,同时显示出了较强的体内外抑制肿瘤生长的作用。它可显著抑制SGC-7901细胞增殖并诱导其发生凋亡,其机制可能是1)通过Bcl-2家族影响线粒体膜电位的变化,并导致下游caspase家族的活化;2)通过激活p53通路引起凋亡。