柑橘绿霉菌CYP51定点突变分析及新型杀菌剂的筛选

论文摘要

柑橘是重要的经济作物,柑橘采后因病害损失巨大。柑橘青绿霉病是柑橘果实在贮运期间发生的最严重病害。据统计柑橘青绿霉病造成的损失一般为10%,严重的高达30%以上,对我国的柑橘产业造成重大的损失。甾醇14α-去甲基化酶（CYP51）是抗真菌剂、除草剂以及降胆固醇药物的重要靶标酶,是唯一广泛存在于细菌、真菌、植物和动物中的细胞色素P450家族成员。它催化甾醇的14α-去甲基化反应。目前农业上最为广泛使用的抗真菌剂是14α-去甲基化酶抑制剂（DMIs）,主要以烯唑醇和三唑酮为代表。但由于杀菌剂的频繁使用,真菌耐药性问题日益凸显。抗药性机理已成为世界范围内农业和医学领域中的研究热点,同时研发新一代低毒、高效、专一性的氮唑类杀真菌剂成为必然。为了研究杀菌剂与靶标酶的相互作用机理以及寻求新型的杀菌剂,本文以柑橘绿霉菌为实验材料,结合分子生物学和计算机辅助技术,通过定点突变手段构建了不同的突变体,研究突变体构象以及与杀菌剂的结合光谱变化；结合先导化合物的离体抑菌活性以及与异源表达的重组柑橘绿霉菌（Penicillium digitatum） CYP51 （Pd-CYP51）的结合能力,筛选出一些潜在的化合物,进一步探讨其构效关系,对指导合成新型高效、低毒、高选择性的DMIs药物具有重要的意义。以真核生物人CYP51为模板进行了Pd-CYP51三维结构的同源模建,从模拟的三维结构推测可能影响Pd-CYP51与杀菌剂相互作用的关键氨基酸。结合氨基酸的保守性从保守区选取112、120、309位点,非保守区选择501位点作为突变点。根据氨基酸的疏水性以及氨基酸侧链基团的大小选取不同的突变氨基酸,构建了不同的突变体,分析了突变体的活性以及与商品化杀菌剂的结合光谱。研究结果表明：Pd-CYP51保守区的112、120、309位点均为杀菌剂与靶标蛋白结合的关键氨基酸,而非保守区的501位点对二者结合的影响较小。突变体均显示P450蛋白的特征峰,表明部分位点的突变均没有影响P450蛋白的活性,但却影响了与杀菌剂结合光谱的变化,结合常数的变大,表明了结合能力的降低。突变成不同的氨基酸,降低的程度不同；影响疏水性空间的保守性氨基酸的突变,大大降低了与杀菌剂的结合能力,影响底物通道的紧缩也会导致结合能力的降低。结合人工合成的先导化合物的离体抑菌活性及与异源表达的重组Pd-CYP51的结合能力,筛选出一些潜在的化合物。通过化合物对柑橘绿霉菌的体外抑菌EC50值测定,发现咪唑类的LWJ-E-13、LWJ-E-20、LWJ-E-21、LWJ-E-39、LWJ-E-41、LWJ-E-42对柑橘绿霉菌的抑菌效果优于商品化的三唑酮,EC50值分别为：23.43、18.23、15.84、10.25、10.26、8.33 mg/L；以Hanes-Woolf作图法分析LWJ-E-13、LWJ-E-20、LWJ-E-21、LWJ-E-39、LWJ-E-41、LWJ-E-42与Pd-CYP51蛋白的结合能力,结合常数Kd依次增大,分别为3.51、2.29、1.65、2.74、1.58、0.896μM。该趋势与它们对柑橘绿霉菌的生长抑制效果相吻合。与商品化的DMIs杀真菌剂烯唑醇、戊唑醇、三唑酮比较,其中LWJ-E-42表现出了最佳的抑菌效果和很强的Pd-CYP51蛋白结合能力,有进一步研发成为新型杀菌剂的潜能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 真菌细胞色素P450研究进展
• 1.1.1 真菌细胞色素P450基因多样性研究
• 1.1.2 真菌细胞色素P450功能分析
• 1.1.3 真菌细胞色素P450数据库
• 1.1.4 真菌的细胞色素P450酶系统
• 1.2 细胞色素CYP51研究进展
• 1.2.1 细胞色素CYP51简概
• 1.2.2 CYP51家族保守性结构研究
• 1.2.3 CYP51晶体结构解析
• 1.3 CYP51与真菌耐药性分析研究
• 1.3.1 DMIs的耐药性机制
• 1.3.2 新型杀菌剂的研发
• 1.4 本文的研究目的、内容及意义
• 第二章 PD-CYP51突变体构建及与杀菌剂结合光谱特性分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 试剂和商品化杀菌剂
• 2.1.3 培养基及仪器
• 2.1.4 主要的缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Pd-CYP51的三维结构的模建与分子对接
• 2.2.2 Pd-CYP51的定点突变
• 2.2.3 重组Pd-CYP51及突变体的活性测定与结合光谱分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 Pd-CYP51三维结构的同源模建和分子对接
• 2.3.2 Pd-CYP51定点突变分析
• 2.3.3 Pd-CYP51突变体的含量与活性测定
• 2.3.4 未突变和突变体蛋白与烯唑醇结合光谱分析比较
• 2.4 讨论
• 第三章 柑橘绿霉菌的新型先导化合物的筛选
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 化学试剂及先导化合物
• 3.1.3 常用培养基和缓冲液
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 不同化合物对柑橘绿霉菌的抑菌率测定
• 3.2.2 重组Pd-CYP51蛋白的制备
• 3.2.3 重组Pd-CYP51的蛋白含量及活性的测定
• 3.2.4 重组Pd-CYP51与化合物的结合光谱分析
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 商品化杀菌剂对柑橘绿霉菌的抑菌率EC50值测定
• 3.3.2 LWJ系列先导化合物对柑橘绿霉菌的抑菌率分析
• 3.3.3 商品化杀菌剂与Pd-CYP51的结合光谱分析
• 3.3.4 LWJ系列先导化合物与柑橘绿霉菌CYP51的结合光谱分析
• 3.4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 硕士期间发表论文
• 衷心感谢以下基金资助
• 附录
• 致谢