鸡胚性分化早期性别差异表达miRNA的靶基因研究

论文摘要

miRNA是一类长度约为20-24个核苷酸的小分子非编码RNA家族,它通过调控靶基因转录后的表达而在多种生物学途径中发挥作用。前期研究发现,鸡胚性腺早期发育过程中存在性别差异表达的miRNA,但对于其靶标的识别以及它在鸡胚性腺分化中的调控作用还未确定。为研究miRNA在鸡胚早期性分化过程调控的靶基因,探讨miRNA在性腺早期发育中的作用,本研究以前期筛选出的鸡胚早期性别差异表达miRNAs为研究对象,首先通过定量PCR和WISH方法验证miRNA的表达,然后通过生物信息学结合实验验证的方法对候选miRNA的靶基因进行了分析。本研究所取得的结果如下：1.应用定量RT-PCR方法检测了5个miRNAs在性分化关键期（E3.5-6.5d）雌、雄鸡胚中的表达。结果表明,miR-92在所检测的各时期（除E4.5d外）中的表达均为雄性极显著高于雌性（P<0.01）,miR-2954的表达则是在E4.5d雄性中极显著高于雌性（P<0.01）：另外,miR-107、1767和31这3个miRNAs呈现前期（E3.5-4.5d）雌性高表达后期（E5.5-6.5d）雄性高表达的趋势。2.利用WISH方法构建了雄性高表达的miR-92的空间表达谱。结果表明miR-92在E5.5、6.5 d胚胎UGSs/性腺部位的表达均为雄性高于雌性,且性腺部位表达明显高于UGSs部位。3.通过TargetScan和miRDB对miR-92进行靶基因预测,结合功能分析、miRNA与靶基因形成二级结构及自由能的结果,初步选定ATRX为miR-92在鸡性腺发育中可能调控的靶基因。4.通过双荧光素酶报告基因法对生物信息学预测的靶基因进行验证,结果表明miR-92能显著抑制融合ATRX3’UTR的报告基因的荧光表达量（P<0.01）,说明ATRX可能是miR-92的靶基因。5.通过半定量方法检测ATRX在性分化关键期（E3.5-6.5d）雌、雄鸡胚性腺中的表达,结果表明它与miR-92在各时期（除4.5d）的表达趋势相反,故推测miR-92可能通过抑制靶基因ATRX的表达来调控鸡的性腺发育。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 文献综述
• 1.2.1 miRNA的生物合成及其作用机制
• 1.2.1.1 miRNA的生物合成
• 1.2.1.2 miRNA的作用机制
• 1.2.2 miRNA靶基因的预测
• 1.2.2.1 生物信息学方法预测miRNA靶基因
• 1.2.2.2 生物实验方法预测miRNA靶基因
• 1.2.3 miRNA靶基因的鉴定
• 1.3 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品
• 2.1.2 细胞系和质粒
• 2.1.3 所用试剂和试剂盒
• 2.1.3.1 主要试剂和试剂盒
• 2.1.3.2 主要溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 生物信息学分析相关的软件和数据库
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA的提取及质量检测
• 2.2.2 时间表达谱分析
• 2.2.2.1 相关引物的设计
• 2.2.2.2 cDNA第一链的合成
• 2.2.2.3 miRNA的扩增及检测
• 2.2.2.4 定量检测分析
• 2.2.3 空间表达谱分析
• 2.2.3.1 探针的合成以及纯化
• 2.2.3.2 斑点杂交检测探针标记效率和量
• 2.2.3.3 胚胎干粉的制备以及Fab片段的预吸附
• 2.2.3.4 WISH程序
• 2.2.4 靶基因ATRX 3’UTR双荧光素酶报告基因载体的构建
• 2.2.4.1 靶基因3’UTR的扩增
• TM-2的连接及测序'>2.2.4.2 靶基因3’UTR与载体psiCHECK^TM-2的连接及测序
• 2.2.5 细胞培养及转染
• 2.2.5.1 鸡成纤维细胞系（UMNSAH/DF-1）的培养
• 2.2.5.2 细胞转染
• 2.2.6 双荧光素酶报告基因的检测
• 2.2.7 靶基因ATRX的时间表达谱分析
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA提取及质量检测结果
• 3.2 时间表达谱分析
• 3.3 空间表达模式分析
• 3.3.1 斑点杂交结果
• 3.3.2 gga-miR-92的表达
• 3.4 gga-miR-92靶基因预测及分析的结果
• 3.5 双荧光素酶报告基因载体的构建结果
• 3.5.1 ATRX 3’UTR序列的扩增
• 3.5.2 pUM-T-ATRX 3’UTR重组质粒的鉴定
• TM-2-ATRX 3’UTR重组质粒的鉴定'>3.5.3 psiCHECK^TM-2-ATRX 3’UTR重组质粒的鉴定
• 3.6 双荧光素酶报告基因的检测结果
• 3.7 ATRX时间表达谱结果
• 4 讨论
• 4.1 miRNA的表达谱分析
• 4.2 生物信息学预测鸡miRNA靶基因
• 4.3 靶基因的鉴定分析
• 4.4 miR-92与ATRX在鸡雄性性腺发育中的可能调控功能
• 5 小结
• 5.1 本研究所取得的结果
• 5.2 本研究的创新点和特色
• 5.3 下一步需要研究的问题
• 附录
• 参考文献
• 致谢