论文摘要
急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）是起病急且持续进展的可逆性肝功能不全。由于肝脏合成、代谢、转运和排泄等功能发生严重障碍，发病4周内可发生肝性脑病，并伴随严重凝血障碍、黄疸、腹水，最终出现多器官衰竭而导致死亡。ALF的发病机制目前尚未完全明了，大多认为与内毒素血症、炎性细胞激活及炎症介质分泌、免疫和线粒体损伤以及能量代谢障碍等密切相关。目前ALF的治疗除肝移植和N—乙酰半胱氨酸（扑热息痛中毒的解毒剂）能使死亡率略有降低外，并无其他有效治疗措施。如不施行肝移植术，死亡率可高达80％-90％。病因的多样性、发病机制的复杂性和病情的急骤进展使ALF死亡率一直居高不下而成为临床和相关学科的研究热点。因此，寻找治疗ALF的有效药物具有重要的临床意义。双环醇是具有我国自主知识产权、治疗慢性病毒性肝炎的国家一类新药。临床试验结果显示，双环醇可明显改善慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者的临床症状并降低升高的血清转氨酶，同时兼有一定抗乙型肝炎病毒作用。以往药理研究表明，双环醇对多种化学毒物如四氯化碳、D—半乳糖胺（D-galactosamine，D-GalN）等所致肝损伤及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、ConA引起的免疫性肝炎均有明显的保护作用，其保肝作用机制与清除自由基、保护线粒体功能和调节前炎症因子水平密切相关。双环醇对实验性ALF的作用尚未见研究报道。已知ALF的病因不仅是判断预后的指标，也是进一步治疗的重要依据。据临床统计，ALF最常见病因为病毒性肝炎，其次为扑热息痛（acetaminophen，APAP）中毒。因此，本研究根据双环醇的药理作用特点，应用LPS／GalN和APAP两种常见ALF诱因引起的急性实验性肝衰竭动物模型，观察双环醇对不同病因引起的ALF是否具有保护作用，并进一步探讨其相关作用机制。1．双环醇对LPS／GalN诱导小鼠急性肝衰竭的保护作用及机制研究GalN（800 mg/kg）致敏小鼠注射小剂量LPS（15μg／kg）可导致急性肝衰竭，肝脏生物化学及代谢方面的改变与临床病毒性ALF较为相似，可同时出现内、外源性内毒素血症。因此本研究应用LPS／GalN诱导的小鼠ALF模型，探讨双环醇对病毒性肝衰竭的保护作用及相关作用机制。GalN致敏动物注射LPS后导致严重的肝损伤可表现为血清转氨酶升高（ALT升高20倍，AST升高2倍）、凝血酶原时间延长（28％）、凝血酶原活动度降低（62％）、高胆红素血症以及肝组织出现严重出血和坏死，甚至引起70％动物死亡。双环醇预防和治疗给药（150，300 mg/kg）均可显著降低LPS／GalN引起的小鼠血清ALT、AST及TBil异常增高，肝组织形态学病变也明显改善，并呈一定的剂量效应关系。双环醇300mg／kg预防和治疗给药还分别使延长的PT缩短13％和9％，使PTA提高56％和32％。此外，双环醇预防给药还可明显减少LPS／GalN引起的动物死亡，使死亡率降至25％。LPS／GalN诱导肝衰竭的损伤机制中，抗炎因子与前炎症因子水平失衡是产生炎性损伤的主要因素。注射LPS／GalN后，小鼠前炎症因子TNF-α、IFN-γ水平显著升高，分别为正常组的14倍和18.7倍；而抗炎因子IL-10水平有轻度升高，为正常组的2.1倍。双环醇300mg／kg预防或治疗给药可抑制LPS／GalN引起的血清TNF-α、IFN-γ水平升高，使TNF-α水平分别降低70％和82％；IFN-γ降低至正常水平。双环醇还可明显提高IL-10水平（两给药组分别升高20％和22％）。CD14、TLR4是组成LPS受体的关键部分，在LPS信号转导途径中起重要作用。黏附分子ICAM-1／LFA-1则可介导肝脏炎性反应时的细胞黏附，导致细胞毒性肝细胞损伤。小鼠注射LPS／GalN后，肝组织ICAM—1、LFA—1、CD14及TLR4 mRNA的表达明显增加；其中CD14及TLR4 mRNA表达分别增加了46％和39％。双环醇300mg／kg预防或治疗给药均可不同程度地减少上述分子在肝组织的异常表达。由此可见，双环醇对LPS／GalN引起的小鼠急性肝衰竭具有明显预防和治疗作用，其作用机理与抑制LPS受体CD14、TLR4的表达，从而下调前炎症因子TNF-α和IFN-γ水平，上调抗炎因子IL-10水平，降低黏附分子ICAM—1和LFA—1的表达密切相关。2．双环醇对APAP诱导小鼠急性肝衰竭的保护作用及机制研究APAP过量中毒是急性肝衰竭的另一临床常见病因，由其引起的急性肝衰竭的发生率和死亡率一直居高不下。与病毒性肝炎诱发的肝衰竭比较，两者的发病机理既有共性又各具特点。因此本实验应用APAP中毒所致小鼠肝衰竭模型，研究双环醇的肝保护作用特点以及相关作用机制。小鼠腹腔注射APAP（260 mg/kg）可导致严重的肝损伤，除血清转氨酶异常升高及高胆红素血症外，糖原和蛋白水平也显著降低（分别降低34％和66％）。同时，肝组织出现严重出血和坏死，大剂量（300mg／kg，ip）还可引起90％动物死亡。双环醇预防和治疗给药（150，300 mg／kg）均可显著降低APAP引起的小鼠血清ALT、AST及TBil异常增高，减轻肝组织坏死和炎症细胞浸润，并呈一定的剂量效应关系。同时，双环醇还可抑制肝脏蛋白质和糖原水平下降，调节血糖水平。此外，双环醇（300mg／kg）预防和治疗给药可将APAP引起的动物死亡分别降至20％和40％。氧化／硝化应激是APAP引起严重肝损伤的重要机制之一。模型组小鼠可见血清NO、MPO水平及iNOS活性明显升高，分别为正常组的1.5倍、2.3倍和2倍。肝脏iNOS及硝基酪氨酸（NT）蛋白表达也显著增强，为正常组的1.4倍及3.8倍。双环醇300mg／kg预防及治疗给药可明显降低APAP引起的NO、MPO水平升高，抑制肝脏iNOS的活性及过度表达，将增强的NT表达降至正常水平。体外实验结果显示，双环醇5、10、50及100 uM皆可抑制APAP引起的肝细胞损伤、ALT异常升高及GSH含量下降，且呈一定浓度—效应关系。APAP中毒还可导致线粒体功能损伤及能量代谢障碍。小鼠腹腔注射APAP后，ATPase活性降低为正常组的47％，双环醇（300mg／kg）预防和治疗给药可使ATPase活性分别提高49％和53％。线粒体功能损伤还可诱发线粒体渗透性转换（MPT）的发生。小鼠注射APAP后出现膜电位异常，对荧光探针Rodamine 123摄取量及摄取速率远小于正常组（荧光值下降幅度正常组-1059.53 vs APAP组-477.56）。此外，对低pH值和高钙浓度反应液诱发肿胀的敏感性也相应降低，吸光度下降幅度仅为正常组的14％和5％，且在较短时间内即达到平衡。双环醇（300mg／kg）预防及治疗给药可明显改善受损线粒体的功能，保持相对正常的膜电位和膜的完整性，表现为线粒体对荧光素的摄取数量有所恢复和荧光值出现回升现象；对低pH值引发的吸光度下降幅度可恢复并接近正常水平，对高钙引发的吸光度下降幅度明显回升为正常组的43％和35％。小鼠注射APAP后血清前炎症因子水平变化明显。血清IL-1β在APAP注射后1h即有升高，12h达峰，约为正常水平的20000倍（正常组0.02pg／ml vs APAP组435.79pg/ml）。双环醇300mg／kg预防及治疗给药在APAP注射后各时间点均可显著抑制IL-1β的异常升高。与模型组比较，12h时间点两给药组IL-1β水平分别降低了53％和40％。同时，小鼠血清MIP-2水平也于注射APAP后12h达峰，约为正常水平的1500倍（正常组0.26pg／ml vs APAP组450.99pg／ml）。双环醇（300mg／kg）预防及治疗给药在各时间点均可显著抑制其水平异常升高；在12h时间点两给药组MIP-2水平分别降低了84％和78％。由此可见，双环醇预防给药及治疗给药对APAP引起的小鼠肝衰竭和死亡具有良好的保护作用，其肝保护作用机制主要是通过抑制iNOS的活性和表达上调从而降低NO水平、抑制MPO升高及GSH耗竭减轻氧化应激；通过下调NT表达而抑制硝化应激；维持线粒体膜的完整性和正常膜电位、提高ATPase的活性而改善线粒体功能；降低前炎症因子水平而发挥抗炎保肝作用。综上所述，双环醇对LPS／GalN和APAP诱发的小鼠肝衰竭具有良好的保护作用，不仅可明显改善血清转氨酶异常升高和高胆红素血症，肝脏出血、坏死及炎症浸润等病理形态学损伤也明显减轻。此外，LPS／GalN引起的凝血功能障碍、APAP引起的肝脏蛋白和糖原水平下降以及动物死亡也得到较好控制。双环醇对小鼠实验性肝衰竭的保护作用机制可归纳为：1)调节LPS受体表达：下调CD14、TLR4 mRNA表达水平。2)调控前炎症因子与抗炎因子平衡：下调前炎症因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β及MIP-2水平，上调抗炎因子IL-10水平。3)调控黏附分子表达：下调ICAM-1、LFA-1表达水平。4)抗氧化／硝化应激：抑制iNOS的活性和表达上调，降低NO水平，减少MPO含量及提高GSH水平，下调NT表达。5)保护线粒体功能：提高ATPase活性，维持线粒体膜的完整性和正常膜电位。上述研究为进一步了解双环醇肝保护作用特点以及临床治疗急性肝衰竭的可能性提供了有参考价值的实验依据。
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