论文摘要
目的癫痫是一种常见的神经系统疾病。动物实验和临床资料表明,脑内锌稳态的变化和癫痫的发生发展是相关的。脑内可以被组织化学染色的锌离子为游离锌离子,又称可螯合锌离子（chelatable zinc ion）。这些锌离子主要位于含锌神经元（zinc-enriched neurons,ZEN）轴突末端的突触小泡内。当神经活动时,这些锌离子通过胞吐作用释放到突触间隙与某些受体结合或者穿越突触后膜进入到突触后神经元进而发挥其调节作用。近年来,锌转运体家族成员（Zinc transporter familymembers,ZNTs）被学者们一一发现,促进了锌稳态研究的发展。锌转运体3（zinctransporter 3,ZNT3）是锌转运体家族中的一个成员,是参与锌离子转运相关的蛋白质。ZNT3表达在ZEN轴突终末的突触小泡膜上,其功能是转运锌离子进入突触小泡内。目前,有关锌离子及其锌转运体ZNT3与癫痫发病机理的关系还不十分清楚。但有研究表明两者与癫痫的发生发展有着非常密切的联系。本实验旨在研究锌离子在癫痫发作过程中分布变化以及ZNT3在模型动物海马MFS的分布表达情况。实验方法一、匹罗卡品小鼠癫痫模型的建立模型组CD-1小鼠经腹腔注射匹罗卡品（300mg/kg,ip）。对照组小鼠注射等量的生理盐水。动物于注射匹罗卡品前半小时预先腹腔注射阿托品（1mg/kg）以阻滞外周胆碱能反应。小鼠在注射匹罗卡品后观察其行为学变化,实验动物痫性发作等级评价标准采用经Becker等修改后的Racine（1972年）分级标准。二、EEG记录麻醉后,脑立体定位仪固定小鼠,于前囟点（Bregma）向后X=2.30mm,矢状缝（sagittal suture）旁Y=2.10mm,硬膜下Z=2.0mm定位海马,钻孔并埋藏电极,动物饲养一周后,于腹腔注射匹罗卡品的同时,观测并记录实验动物海马EEG波形。三、甲酚紫染色与海马细胞计数动物麻醉后,常规灌流、固定、取材、切片。甲酚紫染色,常规脱水透明,光镜下观测,并进行海马DG、CA1、CA3区神经元细胞计数。四、TUNEL染色实验动物麻醉后,常规灌流、固定、取材、切片。切片浸入3%H2O2 PBS液5min以消除内源性过氧化物酶反应。0.01M PBS（pH 7.4）冲洗5min×3次。滴加20%小牛血清和3%小牛血清白蛋白孵育15min,封闭非特异性反应。滴加反应液20μl（TdT 2μ1,荧光素连接的核苷酸混合缓冲液18μl）,切片置于湿盒内（37℃,1h）。PBS洗5min×3次。然后滴加反应终止液（10min,RT）,抗地高辛过氧化物酶抗体（30min,37℃,每次换液前均用PBS冲洗3次,每次5min）。最后DAB显色,光镜下观察,并进行海马DG、CA3的TUNEL阳性细胞计数。五、硫化锌AMG染色实验动物麻醉后立刻灌流,每只实验动物首先灌注0.3%硫化钠溶液10min约150ml,然后灌注生理盐水10min约150ml,最后灌注2.5%戊二醛10min约150ml。常规取材、固定、切片后,AMG孵育液孵育（26℃）,常规脱水、透明、封片、光镜下观察。电镜部分:灌流、固定、取材与前相同,震动切片50μm,AMG孵育液孵育后,常规电镜切片制作,电镜下观察。部分电镜包埋块制作1μm半薄切片,进行AMG阳性反应颗粒图象分析。六、硒化锌AMG染色实验动物腹腔注射0.1%硒酸钠（20mg/kg）。动物存活1.5小时后,腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉。手术打开胸腔,暴露心脏,用蠕动泵经左心室灌注生理盐水150ml和2.5%戊二醛150ml。取材、固定、切片染色等过程同上。电镜部分的制作过程同上。七、TSQ荧光染色过量麻药处死动物,迅速取出大脑,放入液氮中冷冻,将样品置于冰冻切片机中,冰冻切片20μm。避光条件下,切片浸入4.5μM TSQ溶液中孵育60-90秒,然后用0.9%生理盐水冲洗60秒,荧光显微镜观察。八、Zinquin荧光染色过量麻药处死动物,迅速取出大脑,放入液氮中冷冻,然后用冰冻切片机制备20μm厚的冰冻切片。冷丙酮固定10min,Zinquin荧光溶液（1:50）孵育2h（避光）,0.1M PBS冲洗3次各10min,荧光显微镜观察。九、ZNT3免疫组织化学染色实验动物麻醉后,常规灌流、固定、取材、切片,3%H2O2 10min,BSA封闭1h,ZNT3一抗孵育过夜（4℃）,二抗常温孵育2h,SABC常温孵育1h,DAB显色,常规脱水透明后光镜下观察。电镜部分:取材、灌流（灌流液为4%多聚甲醛/0.025戊二醛）、固定同上,震动切片50μm,免疫组织化学染色步骤同上,锇酸染色,后常规电镜包埋块制作,超薄切片,醋酸铀染色,电镜下观察。十、ZNT3 Western Blot分析过量麻药处死动物,迅速取大脑并剥离海马,样品剪碎后加入裂解液4℃过夜。考马斯亮蓝法进行蛋白定量,各组取等量蛋白,聚丙酰胺凝胶电泳分离,并转至PVDF膜上;脱脂奶粉溶液封闭3—7h;一抗孵育过夜（4℃）;二抗常温下孵育2h;后进行显色、曝光、胶片扫描、定量分析。结果一、匹罗卡品致SE小鼠行为观察实验动物匹罗卡品腹腔注射后,经历5-15min的潜伏期,动物表现为:凝视不动、咀嚼、吸鼻或探索行为、湿狗样震颤、反复头颈上仰、吸鼻加强并伴眨眼、面肌痉挛、点头等。此后,动物开始出现Ⅲ级以上发作,50%的实验动物经多次Ⅲ级以上发作后,进入不能自行停止的持续发作状态,即SE。实验动物进入SE的时间大约为25—35min。大约50%的实验动物被诱发出SE,20%左右的模型组动物经历SE后死亡。最终30%左右的模型组动物经历SE并存活。经过15—25天的静息期后,大约90%的成模小鼠观察到1-4次SRS。二、EEG观测结果对照组实验动物,清醒状态下,记录到的EEG以低幅α,β波为主,背景活动较低。潜伏期,模型动物EEG偶尔记录到单个中等幅度的尖波。实验动物开始痫性发作的时候,EEG显示为爆发的锋电位丛,这些锋电位丛被正常背景脑电图所间隔。实验动物SE发作的时候,EEG锋电位丛表现为有规律的,节奏几乎一致的尖波/棘波群。三、甲酚紫染色及海马神经元计数光镜下可见,对照组实验动物海马未见明显的神经元变性改变。模型组实验动物CA1区和CA3区及DG区可见许多神经元发生变性、坏死。SE后24h神经细胞变性坏死最为严重。海马各区细胞计数:模型组海马各区细胞计数减少,与对照比较均有统计学意义（P＜0.05）。四、TUNEL染色结果对照组实验动物在海马DG和CA3区TUNEL阳性反应细胞很少。SE后48h,TUNEL阳性细胞数量在模型动物DG和CA3区明显增多。SE后72h,阳性反应细胞的数量达到高峰。TUNEL阳性细胞计数结果:SE后海马DG和CA3区TUNEL阳性细胞增多,与对照组进行比较均有统计学意义P＜0.01。五、硫化锌AMG与对照组小鼠相比,SE后1h至SE后2h小鼠海马的AMG染色逐渐变浅。与此相反,SE后1h至SE后2h小鼠海马的血管AMG染色逐渐变深。SE后24h小鼠海马AMG染色强度基本恢复到对照组的水平,其AMG血管染色仍较对照组略微增强。电镜下可见各组实验动物苔藓纤维末端突触间隙内均能见到AMG阳性反应颗粒。SE 1h、2h突触间隙出现AMG阳性反应颗粒的几率较多,且间隙内AMG反应颗粒数目也较多。在对照组,电镜下可见有AMG颗粒存在的突触间隙占总数的3.6%,SE 1h组AMG颗粒阳性的突触间隙占总数的14%,SE 2h组,AMG颗粒阳性的突触间隙占总数的17.6%,SE 24h组AMG颗粒阳性的突触间隙占总数的4.8%。SE 1h和SE 2h组有AMG颗粒存在的突触间隙计数与对照相比有显著性差异（P＜0.01）。此外,对照组毛细血管内皮基膜AMG反应颗粒较少,而SE后1h组和2h组,毛细血管内皮基膜内AMG阳性反应颗粒分布逐渐增多,SE后24h组的毛细血管基膜内AMG阳性反应颗粒数量则与对照组类似。半薄切片油镜下CA3区苔藓纤维以及CA1放射层锌离子在各组实验动物海马内的分布情况:与对照组相比,SE后1h、2h后AMG染色强度逐渐递减,而SE后24h,AMG染色强度则与对照组类似。图象分析结果:SE后1h组CA3区AMG阳性反应总面积与对照组相比有显著性差异（P＜0.05）。SE后2h组CA3区AMG阳性反应总面积与对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。SE后1h、2h组CA1区放射层AMG阳性反应总面积与对照组相比有显著性差异（P＜0.01）。六、硒化锌AMG染色与ZNT3免疫组织化学染色对照组小鼠海马齿状回颗粒细胞层以及IML未见异常AMG与ZNT3染色。SE 30d组,异常穿越颗粒细胞层的苔藓纤维数量增加,同时,IML内的AMG与ZNT3染色比较密集,形成了一条环绕颗粒细胞层的条带。SE后60d,穿越颗粒细胞层的芽生苔藓纤维继续增多,其在IML形成的致密染色条带且颜色继续加深。电镜下可见,SE后30d模型动物海马内分子层可见被AMG及ZNT3染色阳性的突触结构。AMG颗粒呈现黑点状,大小不等,位于突触小泡的分布区域。而ZNT3免疫染色则主要定位于突触小泡膜上。SE后60d的实验动物,电镜下表现与SE 30d组类似,但突触前部AMG阳性颗粒与ZNT3免疫染色数量和强度明显增强。七、TSQ和Zinquin荧光染色对照组,两种荧光染色均能较好的标记苔藓纤维,而颗粒细胞层及内分子层未见荧光染色。SE 15d组,两种荧光染色阳性反应开始出现在颗粒细胞层。SE 30d组除了颗粒细胞层有荧光反应外,IML开始出现荧光反应。SE 60d组IML出现荧光染色条带。八、Western blot结果应用ZNT3多克隆抗体检测,约在42KD处可见特异性染色条带。对条带进行灰度测定和分析,发现模型组动物海马ZNT3含量明显增加,与对照组相比SE15d组（P＜0.05）,SE30/60d组（P＜0.01）。ZNT3的表达量与SE后动物存活时间呈正相关。结论1、在癫痫发作过程中,模型动物海马苔藓纤维末端突触前部的锌离子可以进入突触间隙内发挥作用。2、在癫痫发作过程中,模型动物海马锌稳态发生明显变化,苔藓纤维内外锌离子出现同步性减少,同时海马内毛细血管向组织中锌转运加强作为一种代偿反应。3、TSQ荧光和Zinquin荧光可以大致体现出MFS的染色特征,但不能显示出神经纤维染色的细节结构。4、SE后30d、60d实验动物海马MFS有ZNT3的表达,且ZNT3在MFS上的分布与锌离子在MFS上的分布存在着空间以及时间上的一致性。说明ZNT3可以作为一种新的检测MFS的标记物。5、ZNT3在海马内表达含量有随着实验动物SE后存活时间延长而增加的趋势。说明ZNT3可能在癫痫的发生发展过程中起着某种作用。