论文摘要
目的：白血病是我国儿童最常见的恶性肿瘤之一，临床化疗药物的不断改进使白血病治疗取得了飞速进展，但仍有许多化疗药物毒副作用很强，致使部分患者因不能耐受而放弃治疗。本研究旨在探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin-3-gallate，EGCG）体外诱导白血病HL-60细胞凋亡及其机制，为临床开发新的抗白血病药物提供实验资料和理论依据。方法：首先采用MTT法检测EGCG抑制HL-60细胞生长的半数抑制浓度（IC50值）；其次通过绘制细胞生长曲线和软琼脂集落形成实验观察EGCG抑制HL-60细胞的增殖情况；然后利用吖啶橙（AO）染色、流式细胞术及DNA凝胶电泳法检测EGCG诱导HL-60细胞的凋亡情况；同时采用实时荧光定量RT-PCR和Western-blot检测EGCG处理后HL-60细胞中AKT1基因和蛋白的表达，最后分析AKT1蛋白的磷酸化水平与Caspase-3蛋白活化的情况。结果：1.MTT结果显示：EGCG抑制HL-60细胞增殖的IC50值为58.70mg·L-1；2.细胞生长曲线结果显示：随着EGCG浓度增加，处理时间延长，对HL-60细胞生长抑制作用不断增加，且呈浓度依赖性（n=3，P<0.05）；3.软琼脂集落形成实验结果显示：随着EGCG处理浓度的增加，HL-60细胞形成的集落体积逐渐变小，集落数目减少，呈浓度依赖性抑制集落的形成（n=3，P<0.05）。4.吖啶橙（AO）染色结果显示：EGCG处理HL-60细胞后，细胞呈现桔红色或红色核固缩、核边集和核碎裂等典型凋亡细胞形态学特征，随着EGCG浓度的增加，凋亡细胞数目不断增多（P＜0.05）。5.流式细胞术检测结果显示：随着EGCG浓度的升高，HL-60细胞的凋亡率逐渐增加，其呈浓度依赖性诱导HL-60细胞的凋亡。6. DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：EGCG处理HL-60细胞后，琼脂糖凝胶电泳检测可见DNA梯形条带，且随着浓度升高，梯形条带越明显。7.实时荧光定量RT-PCR结果显示：随着EGCG浓度的升高，AKT1基因表达逐渐降低（P＜0.05），呈浓度依赖性抑制AKT1基因的表达。8. Western-blott检测结果显示：随着EGCG浓度的升高，HL-60细胞中AKT1蛋白的表达逐渐降低（P＜0.05），呈浓度依赖性抑制AKT1蛋白的表达。9.磷酸化AKT1蛋白和活化Caspase-3蛋白的Western-blot检测结果显示，HL-60细胞中AKT1蛋白的磷酸化水平随着EGCG浓度增加逐渐降低（P＜0.05），而Cleaved Caspase-3蛋白量却随着EGCG浓度增加逐渐升高（P＜0.05）。结论：EGCG通过抑制AKT1的表达及磷酸化，诱导HL-60细胞凋亡。